水稻可溶性OsVDAC5蛋白的外源表达及鉴定.docVIP

水稻可溶性OsVDAC5蛋白的外源表达及鉴定 摘要：通过生物信息学分析确定水稻（Oryza sativa L.）OsVDAC5的可溶性肽段，将相应的编码区克隆于pGEX-4T-1原核表达载体中，进行IPTG诱导表达和GST亲和层析纯化，利用SDS和Western Blot检测目的蛋白。结果表明，成功构建的pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表达载体，经过体外IPTG诱导，在35 kDa处可检测到可溶性目的蛋白，并获得外源蛋白表达的最适温度为15 ℃和最佳诱导时间为8 h；经过GST亲和层析，SDS可检测到较为单一的蛋白条带，得到纯化的GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白。 关键词：水稻（Oryza sativa L.）；OsVDAC5；可溶性表达；亲和层析 中图分类号：S511；Q816 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2921-05 DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.054 电压依赖性阴离子通道蛋白（Voltage-dependent anion channels，VDAC）是线粒体外膜上具有高度保守性的孔状蛋白，由一种小的多基因家族编码，广泛存在于真核生物中[1]，并在能量代谢、细胞凋亡、物质运输和信号转导过程中起着决定性作用[2-4]。VDACs最早从草履虫（Paramecium aurelia）线粒体外膜上分离得到[5]。哺乳动物中主要有3种VDAC亚型[6]，真菌中主要有2种亚型[6]，而在植物中，烟草中至少有3种VDAC亚型，大豆、蒺藜苜蓿、百脉根和拟南芥中至少有5种不同的亚型[7-10]，水稻中存在8个VDAC基因[11]。与哺乳动物和真菌相比，植物中有更多的VDAC异型体，表明植物VDAC具有多种不同的功能，但它们都有着相同的离子选择性和电压依赖性特性，并且具有相似的电生理学特征，说明VDAC在结构和功能上具有一定的保守性[12]。近年来，研究发现植物VDAC在植物的生长和发育阶段以及在生物和非生物胁迫响应方面都发挥着重要作用[10，13，14]。拟南芥中AtVDAC3能同叶绿体蛋白AtTrx m2相互作用，参与ROS信号通路，以应答盐胁迫[15]；AtVDAC1能同CBL1相互作用，在种子萌发与植物发育过程中负调控植物对外界温度的应答[13]。超表达OsVDAC3显著提高了水稻的抗盐性和抗旱性[16]。前期研究表明，OsVDAC5基因在YTA水稻生殖生长期达到最高表达水平[17]，表明OsVDAC5基因可能在水稻YTA的生殖发育期发挥重要功能。 在体外以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞内凝集，形成包涵体。以包涵体形式存在的蛋白质分子无定形，呈非水溶性，无生物活性，为后续研究带来诸多不便[18]。VDAC蛋白为线粒体外膜蛋白，在原核表达时由于无法形成正确的次级键，大多以包涵体形式存在。虽然可以通过包涵体蛋白变性、复性等方法获得可溶性蛋白，但蛋白质的复性效率低，得到的可溶性蛋白常常会在结构上发生改变，不利于后期进一步研究蛋白质的功能[19]。研究表明，全长的OsVDAC5基因在体外表达时以包涵体形式存在[20]，因此，本研究拟通过生物信息学分析，将OsVDAC5基因截短为可溶性肽段，构建pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）基因片段的原核表达载体进行体外表达，以获得可溶性目的蛋白，为OsVDAC5互作蛋白的研究及其在水稻生长发育过程中的生物学功能分析奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料 原核表达载体pGEX-4T-1、大肠杆菌菌株DH5α、BL21（DE3）以及pET-32a-OsVDAC5质粒均由中南民族大学武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供。 1.1.2 试验试剂 限制性内切酶Quick CutTM BamH Ⅰ、Quick CutTM Xho Ⅰ，T4-DNA连接酶，Ex Taq酶，DL15 000和DL2 000 DNA Marker，GST Fusion Protein Purification Kit均购自Takara公司。DNA凝胶回收和清洁试剂盒均购自Axygen公司。Page RulerTM Prestained Protein Ladder购自Thermo公司。GST Tag Mouse Monoclonal Antibody及二抗羊抗鼠购自Abbkine公司。超敏ECL化学发光即用型底物购自武汉博士德生物工程有限公司。引物合成及测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。 1.1.3 试验仪器 C1000 Touch Thermal Cycler 型PCR仪和凝胶成像分析仪，购自美国Bio-RAD公司；Model 1