焦磷酸化酶.docVIP

高等植物H+-PPase研究进展 摘要：H+-PPase 的属性、功能及其分子生物学的研究进展，并着重阐述H+-PPase对逆境的反应以及在植物抵御盐及干旱胁迫中的作用。 关键字：H+-PPase H+转运无机焦磷酸酶 H+-pyrophosphatase，H+-PPase 是一种区别于H+-ATPase的H+转运酶，广泛存在于植物和少数藻类、原生动物、细菌以及原始细菌中。在液泡膜上，H+-PPase能够把无机焦磷酸 PPi 水解产生的自由能和H+跨膜转运相藕联，在将PPi水解为2个Pi的同时，还将细胞质中的H+经液泡膜进入液泡内，起质子泵的作用，与液泡膜H+-ATPase一起形成H+跨液泡膜电化学梯度，为各种溶质 如阳离子、阴离子、氨基酸和糖类等 分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力。最适pH为7.5~8.5，该酶的结合底物是Mg2PPi，可被K+等阳离子激活，而对阴离子不敏感，但被F-抑制。自 1975年Karlsson从甜菜 Beta vulgaris 根中分离到钾激活的H+-PPase以来，近几十年，此酶的研究已经取得了长足的进展，并对其生理生化性质逐步达成共识。随着分子生物学研究的不断深入，人们已经成功地从拟南芥、大麦、甜菜、烟草、水稻、绿豆等众多生物体中分离到 H+-PPase 的cDNA。此酶的结构和特性，特别是它在植物耐盐抗早中的作用和调节植物生长方面的功能己经逐渐成为众多研究者关注的焦点，近年来，通过克隆并转化 H+-PPase 基因以提高植物耐盐性和抗旱性的基因工程已经展开，现将这方面的研究进展介绍如下。 H+-PPase的属性 1.1 Vmax和Km Davies等计算出 1mol PPi在细胞质中（pH 7.3 水解会产生27.3 kJ 的自由能。Maeshima发现H+-PPase的H+/PPi化学当量为1。H+- PPase在液泡膜中的比活性 specific activity 随不同植物种类、不同组织以及不同的测定方法而出现差异。在绿豆幼苗下胚轴、红甜菜根、拟南芥叶片、南瓜幼苗子叶、海藻以及 CAM植物等生物体中，人们检测到的H+-PPase标准比活性值分别为 1.10 、0.30 、0.52 、0.35 、1.56 和 0.22~0.71μmol PPi · min-1 ·mg-1 membrane protein 。但从这些生物体内纯化出的H+-PPase蛋白的比活性都高于它们的标准值，光合细菌中纯化出的H+-PPase的比活性甚至达到了20 μmol · min-1· mg-1。酶动力学 enzyme kinetics 分析表明，H+-PPase的Km值在不同物种间差异很大，在植物细胞中，酶促反应达到最大速度 Vmax 时所需的底物 PPi 浓度最高约为200 μmol·L-1。 1.2 辅助因子 大量的研究发现，H+-PPase 的底物实际上是 Mg2+ 和 PPi 所形成的一种络合物 Mg2PPi 。同时，游离 Mg2+ 是 H+-PPase 的一个基本的辅助因子，与酶结合后，在保持酶的活性和稳定性中发挥着重要的作用。目前，人们对于H+-PPase 上Mg2+ 结合位点的确切数量还不清楚。但是， Baykov 等发现，在绿豆 H+-PPase上存在两个 Mg2+ 结合位点，即高亲和性结合位点 Km 23 ~ 31 μmol·L-1 和低亲和性结合位点 Km 0.25 ~ 0.46 μmol·L-1 ，并由此推测，单个H+-PPase 分子上可能至少存在两个不同的 Mg2+ 结合位点。Yazaki 等检测到，当细胞质中游离 Mg2+ 达到 0.4 mmol·L-1 时，H+-PPase 能表达出不低于90%的活性。 Mg2+ 与H+-PPase结合对该酶不仅有活化作用，还有保护作用，使其在较高温度下不易失活。 除受Mg2+激活外，H+-PPase 还可能受 K+ 和NH4+等激活。Davies 等通过膜片钳技术发现，K+对红甜菜贮根中的 H+-PPase具有矢量激活效应，这种激活作用只发生在液泡膜的细胞质侧。Pugliarella 等发现萝卜 Raphanus sativus H+-PPase 活性尤其是H+ 转运活性表现出对 K+ 的绝对需要，这己从随后的很多研究中得到证实。研究表明，K+ 的刺激能使 H+-PPase 的活性增大3倍以上，其Km 值在不同植物中表现不一，低至4 mmol·L-1以下，高至60 mmol·L-1以上。一般情况下，当KCl 的浓度达到30 mmol·L-1左右时，酶活性就能达到最大值，但蚕豆 Vicia faba 保卫细胞H+-PPase的活性只有在较高的K+浓度 Km