纳升液相色谱―高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰.docVIP

纳升液相色谱―高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰 　　摘要：多肽组是指生物体表达的所有多肽，尿液等体液的多肽组是生物标记物的重要来源。本研究采用氧化石墨烯磷酸镧纳米磁性复合材料分离富集尿液多肽，进行纳升液相色谱高分辨串联质谱分析，从单一样本中鉴定了归属于123个蛋白质的790条肽段。研究表明，这些肽段在蛋白质水平上不是平均分布的。此外，本研究检测到了肽段的氧化、磷酸化和脱氨化等翻译后修饰现象，观察到了尿液多肽的阶梯序列性，从蛋白水平上对尿液多肽组进行了生物信息学分析，结果表明，这些多肽所归属的大部分蛋白质之间存在相互作用。本方法可为在尿液中寻找疾病的标志物提供方法学支持。 　　关键词 ：多肽组； 纳升液相色谱高分辨串联质谱； 尿液； 翻译后修饰 　　1 引 言 　　随着基因组学、转录组学和蛋白质组学在生命科学领域中的迅速发展[1]，多肽组学的研究也逐渐引起人们的关注。从最简单的腔肠动物到最高等脊椎动物中，大部分动物体内都存在多肽[2]。多肽组学的研究内容包括体液、组织和细胞等生物体内全部内源性多肽的组成、功能和变化规律[3]。有些多肽作为蛋白质合成、加工、降解的产物[4]，可以反映机体内蛋白质的异常代谢过程。蛋白质被剪切成不同的肽段后还可发挥特定的功能[5]。有些多肽作为生化信使分子，如多肽激素、神经多肽、细胞因子、酶抑制因子等，组织调控机体内很多生理生化过程，与疾病的产生有着密切的关系。作为蛋白质组学的延伸，多肽组学技术能很好地监测到低分子量蛋白质的变化。 　　在疾病生物标志物的筛选、疾病诊断、疾病监测、疗效评价及预防等方面，多肽组学也发挥了重要作用[6]。尿液作为机体代谢的终端，用于检测疾病的样本时具有可持续性和非侵袭性的优点[7]。表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱仪（SELDITOF MS）、基质辅助激光解吸电离质谱（MAIDITOF MS或者MAIDITOF/TOF MS）[8]以及ESI串联质谱仪，例如三重四级杆质谱仪、离子阱或者四级杆飞行时间质谱仪[9]都可对多肽进行检测和分析。利用MAIDITOF MS，研究者在胃癌、乳腺癌[10]、膀胱癌[11]，IgA肾病[12]等的早期诊断研究中寻找到一些多肽生物标志物。但是此类方法在在寻找疾病差异多肽时，重点在于差异峰的比较，不能准确鉴定蛋白质及其翻译后修饰。 　　氧化石墨烯磷酸镧纳米磁性复合材料（LaGM）是由石墨烯、LaPO4纳米棒和Fe3O4纳米粒子构成的三重复合材料，能够应用于低丰度多肽的快速富集，如可有效富集尿液中的多肽[13]。本研究采用LaGM分离和富集尿液多肽，采用纳升液相色谱串联高分辨飞行时间质谱仪鉴定多肽序列和翻译后修饰，1.5 mL尿样单一样本中鉴定出归属于123种蛋白质的790条肽段，其中有91条肽段带有氧化、磷酸化和脱氨化翻译后修饰。本研究为利用尿液多肽组研究疾病生物标志物提供了快速高效的分析方法。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Eksigent nanoLCUltraTM 2D 二维纳升液相色谱系统、TripleTOF 5600 高分辨质谱仪、Protein Pilot 4.5软件（AB SCIEX，美国）；真空冷冻干燥机、超纯水仪（Thermo Scientific，美国）；C18反相色谱捕集柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 150 ， Eksigent，美国）；C18反相色谱分析柱（75 μm×15 cm， 3 μm，120 ，Eksigent美国）。 　　LaGM按文献[13]方法自行制备； 实验用水为超纯水；纳升反相色谱流动相A：98%水、0.1%甲酸和2%乙腈，纳升反相色谱流动相B：2%水、0.1%甲酸、98%乙腈。 　　2.3 纳升液相色谱TripleTOF质谱分析 　　将磁性材料分离后冻干的多肽样品用流动相A溶解。在线NanoRPLC液相色谱在Eksigent nanoLCUltraTM 2D系统进行，样品以2 μL/min的流速上样到C18预柱上（100 μm×3 cm，3 μm，150 ），以2 μL/min流速冲洗脱盐10 min。分析柱为C18反相色谱柱（75 μm×15 cm， 3 μm，120 ），梯度洗脱：0～42 min，5%～25% B；42～56 min，25%～40% B；56～64 min，80% B；64～70 min，5% B。质谱分析采用TripleTOF 5600系统（AB SCIEX）结合纳升喷雾III离子源（AB SCIEX），喷雾电压2.4 kV，气帘气压30 psi，雾化气压5 psi，加热温度150℃，一级TOFMS单张图谱扫描时间为250 ms，每次IDA循环下最多采集35个电荷为2+～8+，且单秒计数大于100的二级