小鼠胚胎冷冻保存条件探究.docVIP

小鼠胚胎冷冻保存条件探究 　　摘要：为探索在实验室条件下最佳的小鼠胚胎冷冻保存条件。对不同发育阶段小鼠胚胎按照同一个冷冻程序进行冷冻;两个不同的冷冻程序对同一个发育阶段的小鼠胚胎进行冷冻。结果表明，-7 ℃平衡10 min，然后以0.3 ℃/min的速率迅速降至-35℃，-35 ℃平衡5 min后投入液氮中，此冷冻程序比较适合小鼠胚胎冷冻;冷冻保存对16细胞以上的小鼠胚胎影响较小。 　　关键词：小鼠;胚胎;冷冻保存 　　中图分类号：Q954.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4915-02 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.037 　　Cryopreservation Conditions for Mouse Embryo 　　ZHANG Li-ping1，CAO Hui2，LIU Xi-mei1，BI Yan-zhen1，XIAO Hong-wei1，LI Li1，HUA Zai-dong1，HUA Wen-jun1 　　（1.Institute of Animal and Veterinary Science/ Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agriculture Sciences，Wuhan 430064，China; 2.Pulike Biological Engineering Inc.， Luoyang 471000， Henan， China） 　　Abstract： The optimal cryopreservation conditions of growth stage and cryopreservation process for mouse embryo were investigated. The results showed that the optimal program was putting the embry into -7 ℃ for 10 min， then cooling rate to -35℃ with -0.3 ℃/min， after holding for 5 min， putting it into liquid nitrogen for cryopreservation. It had a small effect on the embryos with more than 16-cell. 　　Key words： mouse; embryo; cryopreservation 　　小鼠胚胎冷冻体外受精胚胎移植自1972年Whittingham等[1]首次用液氮冷冻保存小鼠胚胎成功后，哺乳动物胚胎冷冻保存技术取得了飞跃的进展，在畜牧业和实验动物种质保存中发挥了巨大的作用。随着遗传工程小鼠的大量出现，建立一种常规的安全可靠的胚胎冷冻方法保存这些极其珍贵的遗传资源至关重要。本试验对影响小鼠受精胚胎冷冻因素进行了对比，旨在寻找在本实验室条件下最佳的小鼠胚胎冷冻条件，建立一种适合于本实验室的无需专业实验室人员即可操作的快速简便的动物胚胎冷冻方法，从而用于指导实践。 　　1 材料与方法 　　1.1 小鼠胚胎的获取 　　6～10周龄昆明白雌鼠控光（14 h光照，10 h黑暗）饲养1～2周后，腹腔注射10 IU/支PMSG（宁波激素制品厂）46～48 h腹腔注射10 IU/支hCG（宁波激素制品厂）进行超排。注射hCG后与雄鼠合笼，次日早晨检查阴道栓。 　　见栓雌鼠分别于注射hCG后52～54 h、65～66 h和77 ～78 h处死，采集4-cell、8-cell和16-cell以上细胞。 　　1.2 胚胎冷冻 　　冷冻液为从乙二醇（Ethylene glycol，EG）冷冻液（直接从北京市谭河科技开发中心购买，货号TH044）。先将胚胎移入已经预热过的EG中室温平衡5 min，再装入0.25 mL的塑料细管中，每管2～5个胚胎。将装有胚胎的塑料细管放入冷冻仪（planer，英国）中，按照试验设计的程序运行。运行完毕后，迅速投入液氮罐中保存。 　　1.3 胚胎解冻 　　胚胎冷冻保存1周后解冻。自液氮罐中取出塑料细管，室温下于空气中停留数秒后置入盛有32 ℃水浴的烧杯中，停留数秒。取出细管，将解冻后的胚胎推入平皿中，再移入已经预热的M16，用M16洗3次以便彻底去除EG。 　　1.4 胚胎培养 　　培养液为M16（Sigma），提前2 h将M16做50 μL微滴并覆盖石蜡油，放入CO2培养箱中