高效液相色谱分析法HPLC详解.pptVIP

第八章 高效液相色谱分析法 High Performance Liquid Chromatograph §8.1 概述 Chromatography ~ 利用当流动相带着混合组分在固定相间流动时，由于各组分在两相中有不同的吸附能力、溶解度或渗透性等特性，因而当两相作相对运动时，组分会在两相间进行反复多次分配，使原来微小的分配差异变大，移动速度不同，从而使混合组分得到分离 1. 发展历史 1906 Russian botanist Tsweet 经典液相色谱法 to separate the various plants pigments 1941, Martin and Synge Liquid-liquid partition chromatography 1952，Martin and James Gas chromatography 60年代 采用高压输液泵的高效液相色谱法 70年代 采用电导检测器的离子交换色谱法 80年代末 毛细管电泳分离法  Based upon the physical status of the mobile phase 流动相 Gas chromatography（气相色谱法）: Gas-solid chromatography (气-固色谱法) ~固定相为固体吸附剂 Gas-liquid chromatography (气-液色谱法)~固定相为涂在固体担体或毛细管内壁上的液体 Liquid chromatography（液相色谱法）: Liquid-solid chromatography (液-固色谱法)~固定相为固体吸附剂 Liquid - liquid chromatography (液-液色谱法)~固定相为涂在固体担体上的液体 Superficial-fluid chromatography (超临界流体色谱法) Mobile phase is a substance at temperature and pressure above its critical point 液相色谱法分类 3.高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于：高速、高效、高灵敏度、高自动化 高效液相色谱法与气相色谱法比较 分析对象 GC：只限于分析气体和沸点较低的化合物（占有机物总数的20％） HPLC：可分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质（占有机物总数近80％） 流动相 GC：流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用 HPLC：流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此流动相对分离起很大作用 操作温度 GC：一般都在较高温度下进行 HPLC：通常在室温条件下工作 4.高效液相色谱法的应用 HPLC的局限性 使用多种溶剂做流动相，成本高，污染大 当使用梯度洗脱时，操作比GC的程序升温复杂 缺少通用型的检测器 不能替代毛细管GC去完成柱效高达10万块塔板以上的复杂体系的分离（如多沸程的石油产品） 不能替代中、低压色谱，在200kPa~1MPa下去完成在高压下易分解、变形的具有生物活性的生化样品的分离 §8.2 高效液相色谱仪 液相色谱仪 1. 流动相贮存与脱气 2. 高压泵和梯度洗脱装置 输液泵种类： 恒压泵：可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但输出流量随色谱系统阻力变化而变化，现已较少使用 恒流型：溶剂流量恒定，与柱填充情况无关 机械注射式恒流泵 机械往复式恒流泵：每分钟往复25~100次，脉动小 (2) 梯度洗脱装置 梯度洗脱(Gradient Elution or Solvent Programming): 在样品分离过程中，按一定程序连续改变流动相中的两种或两种以上溶剂的比例，以改变流动相的极性、离子强度和pH等，从而改变被测组分的相对保留值，提高分离效率，加快分离速度 适用于组分分配比k相差很大的体系 梯度洗脱类型: 线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度 阶梯梯度：直接从某一低强度流动相改变为另一较高强度流动相 根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为 高压梯度（内梯度） : 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱 可获得任意形式的梯度，易于实现自动化 溶剂的可压缩性和溶剂混合时热力学体积变化可能影响流动相的组成 低压梯度（外梯度）: 一台高压泵， 通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定比例抽入混合器中混合，然后由高压泵输送至色谱柱中 3. 进样装置 4. 色谱柱 柱的填充（Packing）： 干法： 粒度 20 μm 湿法