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水中细菌总大肠菌群的测定 周艳艳 2013.9.9 执行标准: 生活饮用水卫生标准（GB/T 5749-2006） 生活饮用水标准检验方法（GB/T 5750.12-2006） 总大肠菌群（MPN/100ml）：不得检出 一 、基本概念 总大肠菌群:是指一群在37OC培养24小时能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。在饮用水的微生物安全监测中，大肠菌群是水的粪便污染指标菌，以该菌的检出情况来表示水中有无粪便污染及其程度。因为粪便中可能会带有一些肠道致病菌，所以水中总大肠菌群数的高低，也反映了其对人体健康危害性的大小。 食品中大肠菌群数系以100g(ml)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 MPN:最大可能数的简称.表示样品中活菌的密度.是用概率论来推算样品中菌数近似的数值。 常用的单位: 液体大肠实验------MPN/100ml 二、实验原理 应用乳糖蛋白胨液体培养基,并倒置一杜氏发酵小管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖,而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。细菌产酸后,培养基即由原来的紫色变为黄色。 产气情况可通过倒置小管中的气泡来观察。 三、实验器材 1、恒温培养箱（36℃±1℃ ）、电子天平、 灭菌培养皿、试管等。 2、培养基及试剂： 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板（EMB）等。 四、实验步骤 1、初发酵实验 2、分离培养（伊红美蓝平板） 3、革兰氏染色 4、复发酵实验 5、观察结果并填写实验记录 五、实验方法 1、 分离划线 挑选产酸产气的发酵管，接种 至伊红美蓝平板（分区划线法）。 第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环 操作要点: 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动 2、革兰氏染色 a.涂片：接种环，挑取菌落，无菌水一滴、涂匀 b.干燥：涂布后待其自然干燥 C.热固定：通过火焰2-3次 d.初染：结晶紫染色液，1min钟水洗 e.媒染:革兰氏碘液，作用1min水洗 f.脱色：95%的乙醇，约30s水洗 g.复染:沙黄复染色液，复染1min水洗 h.镜检：油镜观察 镜检：革兰氏阴性呈红色，革兰氏阳性呈紫色 操作要点： 1.选用生长18-24小时的细菌为宜； 2.涂片不宜过厚，火焰固定时不宜过热；(固定的的作用是杀死细菌，使菌体蛋白质凝固在载玻片上，以免染色时被水冲走。) 3.酒精脱色时间一般为20-30s，取决于涂片的厚度，脱色不足或过度均会造成染色的假阳性或假阴性。 五、整个实验过程注意事项： 产酸判断：紫色培养液变成黄色 产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试 管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。 复发酵的结果判断以产气为主 。 谢谢！
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