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武汉生物工程学院 毕业论文 设计 题 目： 银杏黄酮的复合酶法提取优化 类 别： 系 别： 生物科学与技术系 专业班级： 10级生物工程4班 学 号： 10*** 学生姓名： 王XX 指导教师： 李XX/讲师 时 间： 201x年x月至201x年x月 学位论文作者声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。 本人完全了解有关保障、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关学位论文管理机构送交论文的复印件和电子版，同意本论文被编入有关数据库进行检索和查阅。 本学位论文内容不涉及国家机密。 论文题目： 作者单位： 作者签名： 年 月 日 目 录 实验一 曲种质量检验——血球计数板测定孢子数 - 1 - 实验二 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx - 2 - 实验三 xxxxxxxxx - - 实验四 xxxxxxxxxx - - 实验五 xxxxxxxxxxxxxxxx - - 实验六 xxxxxxxxx - - 参考文献 - 4 - 致谢 - 5 - 附录 - 6 - 实验一 曲种质量检验——血球计数板测定孢子数 一、实验目的 掌握应用血球计数板测定孢子数方法。 二、实验原理 种曲是成曲的曲种，是保证成曲的关键，是发酵产酶的基础。种曲质量的优劣，不仅直接影响成曲的质量，而且对原来的利用率与出品率也会造成一定的影响。 种曲质量要求之一是含有足够的孢子数量，孢子旺盛、活力强、发芽率高，所以孢子数及其发芽率的测定是种曲质量控制的重要手段。 种曲质量标准 指 标 二级指标 指标要求 标感官指 外观 菌丝整齐健壮、孢子旺盛、米曲霉呈新鲜黄绿色，黑曲霉呈新鲜黑褐色。无夹心，无杂菌、无异色。 香气 具有种曲固有的曲香、无霉味、酸味、氨味等不良的气味。 手感 用手指触及种曲，松软而光滑，孢子飞扬。 理化指标 孢子数 60亿/g（以干基计）以上 发芽率 90％以上 细菌数 不超过107个/g 目前测定微生物数量方法均采用传统的稀释平板法，此方法测定细菌、酵母菌等单细胞菌类完全适宜，在重现性和准确性上均可达到精度要求。对于酿造工业测定曲霉菌等真菌孢子来讲，可以采用传统稀释平板法和血球计数板直接计数等方法测定。 本实验采用血球计数板在显微镜下直接计数，这是一种常用的细胞计数方法。此法是将孢子悬浮液放在血球计数板与盖片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室中的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的孢子数目来计算单位体积的孢子总数。 实验中，称样时要尽量防止孢子的飞扬。测定时，如果发现有许多孢子集结成团或成堆，说明样品稀释未能符合操作要求，因此必须重新称重、振摇、稀释。生产实践中应用时，种曲通常以干物质计算。 三、实验试剂与仪器 1. 生产菌株：米曲霉三角瓶孢子种（由上实验获得）。 2. 试剂：95%酒精、稀硫酸（1:10）、无菌水。 3. 仪器：显微镜、血球计数仪、载玻片、盖片、旋转式摇床、500ml锥形瓶等。 四、实验步骤 流程： 曲种→称量→稀释→过滤→定容→制计数板→观察计数→计算 （1）精确称取三角瓶种曲1g（称准至0.001g），倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶内，加入95%酒精5ml、无菌水20ml、稀硫酸（1:10）10ml，在摇床上充分振摇（20~30min），使种曲孢子分散，然后用三层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，务使滤渣不含孢子，最后稀释至500ml。 （2）制计数板 取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止5min，待孢子沉降。 （3）观察计数 用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不使之遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。 使用16×25规格的计数板时，只计板上四个角上的4个中格（即100个小格），如下图。如果使用25×16规格的计数板时，除计四个角上的4个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即80个小格）。每个样品重复观察计数不少于2次，然后取其平均值。 血球计数 （4）计算 ① 16×25的计数板 孢子数（个/g） （N/100）×400×10000×（V/G） 4×104×（NV/G）…………（1） 式中：N——100小格内孢子总数（个）； V——孢子稀释液体积（ml）； G——样品重量（g）。 ② 25×16的计数板