略阳乌鸡酪氨酸酶基因（TYR）遗传变异分析.docVIP

略阳乌鸡酪氨酸酶基因（TYR）遗传变异分析 　　摘要：试验通过PCR-SSCP技术检测略阳乌鸡酪氨酸酶基因（TYR）部分启动子区、全部外显子和部分内含子的遗传多样性，并对不同基因型进行了测序和比对分析。结果表明，略阳鸡群体在TYR位点具有较为丰富的遗传变异，在所检测的启动子区有2个单核苷酸多态（SNP）位点；外显子1有2个SNP位点，外显子2、3、4没有检测到变异位点，外显子5存在5个SNP位点；检测的部分内含子2中发现2个SNP位点。mRNA上的7个变异位点有3个发生在编码区，但都是同义突变，没有造成氨基酸变异。表明略阳乌鸡和普通鸡的酪氨酸酶没有氨基酸序列差异，TYR基因在鸡的遗传上是高度保守的。启动子区和内含子区的遗传变异是否与酪氨酸酶的转录剪接和表达量有关，进而影响乌鸡黑色素的沉积还有待进一步研究。 　　关键词：略阳乌鸡；酪氨酸酶基因（TYR）；遗传变异 　　中图分类号：S831；S813.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1123-05 　　略阳乌鸡又称黑河乌鸡，具有“六端乌”（乌皮、乌喙、乌腿、乌趾、乌舌、乌冠），体形大，生长快、产肉多、肉质细嫩鲜香，营养丰富，兼有药用价值，属优良肉用型地方鸡种，其羽色复杂，有黑羽、麻羽、白羽等，是经过长期选育形成的宝贵资源，主要分布于秦岭以南略阳县的黑河坝、观音寺、仙台坝、两河口等地，是陕西省惟一的家禽保护品种，农业部专家组来略阳调研时，将其与泰和乌鸡、郧阳乌鸡、江山乌鸡共同列为中国四大乌鸡品种，2008年被确立为“中国地理标志产品” [1-4]。 　　乌鸡的滋补、药用价值主要是与其体内丰富的黑色素有关， 黑色素具有延缓衰老、清除自由基、抗氧化、抗诱变、抗紫外线、抑制流感病毒等多种生理功能[5-10]。动物黑色素可分为两类， 一是真黑色素（Eumelanin）， 不含硫原子， 呈棕色或黑色； 二是脱黑色素（Pheomelanin），含硫原子， 呈黄色或微红棕色，乌骨鸡黑色素属于真黑色素，主要分布于乌鸡的羽毛、皮肤、骨骼和肌肉中[11，12]。黑色素沉着决定于其所含真黑色素与脱黑色素的相对数量，而黑色素细胞中酪氨酸酶活性和表达量与两种黑色素合成量比例呈正相关[11，13]。 　　酪氨酸酶是控制黑色素生成的限速酶，酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成3， 4-二羟基丙苯氨酸（多巴）， 多巴进一步氧化生成多巴醌， 多巴醌经多聚化反应与氧化反应生成多巴色素， 在多巴色素异构酶作用下， 多巴色素羟化为5， 6-二羟基吲哚羧酸（ DHICA） ， 脱羧成5， 6-二羟基吲哚， 再在酪氨酸酶催化下氧化成5， 6-吲哚醌， 最后与其他中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素合成前期（酪氨酸到多巴醌）与真黑色素一致， 但在以后反应中有半胱氨酸（Cys） 参加， 产生Cys-多巴和Cys-多巴醌， 然后通过关环、脱羧、最终形成脱黑色素[13]。家禽中真黑色素的合成目前多遵循经典的Mason-Raper途径，鸡的酪氨酸酶基因（TYR）定位在1号染色体的长臂4区4带[12，14]。 　　本研究以略阳普通鸡、略阳麻羽乌鸡与略阳黑羽乌鸡3个群体为对象，通过PCR和测序技术检测略阳鸡TYR基因的SNP，分析略阳鸡TYR基因的遗传变异对黑色素形成的影响，探讨略阳乌鸡黑色素形成过程中TYR的分子作用机制，为开发利用这一宝贵资源提供理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　从陕西汉中黑凤乌鸡产业园采集21只略阳黑羽乌鸡（LYHY）的血液，汉中农贸市场采集略阳普通鸡（LYPT）和略阳麻羽乌鸡（LYMY）各1只的血液，加ACD抗凝，置于-70 ℃低温冰箱中保存， 根据《分子克隆实验指南》[15]，采用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE中，4 ℃保存。 　　1.2 引用序列及引物序列 　　从GenBank查得鸡的TYR基因序列（GenBank登录号：L46805 和NC006088）， TYR外显子1及上游序列引物引自文献[16]，采用Primer5.0自行设计TYR外显子2-5的引物，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成（表1）。 　　1.3 PCR扩增反应体系及程序 　　PCR反应总体系为25 μL：10×PCR缓冲液 　　2.5 μL， dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下游引物 　　（10 pmol/L）各1.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 　　0.2 μL ，DNA模板（50 ng/μL）1.2 μL，超纯水18.2 μL。 　　PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55～60 ℃（表1）退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行34个循环；72 ℃延伸7 min；12 ℃保存。