003-生物技术(细胞-2011)优秀课件.pptVIP

十二.蛋白芯片:检测基因表达 第三章. 细胞生物学技术西安交通大学医学院遗传与分子生物学系胡晓岩 模型生物 第一节.显微镜技术 一.显微镜与分辨率： 人的肉眼分辨率为0.2mm, 光镜分辨率为0.2μm, 电镜分辨率为0.2nm。 分辨率(resolution)是指将临近两点清晰区分辨认的能力,以r表示: r = 0.61λ/n sinα 分辨率取决于光的波长(λ)和物镜的数值孔径(numerical aperture, NA)。 λ=0.53μm，n sinα 即NA (干透镜最大不超过1, 油镜可达1.4)。 二.光学显微镜技术： 标本制备:材料的固定→包埋→切片→染色 1.普通光学显微镜:最大分辨率为0.2μm 2.荧光显微镜:揭示细胞或细胞间质中的大分子 3.相差显微镜:直接观察活细胞 4.激光扫描共聚焦显微镜:获得细胞结构的三维图象 5.荧光漂白恢复技术:检测活体细胞表面或内部分子运动情况 三.电子显微镜技术： 1.电子显微镜的种类： 透射电镜、扫描电镜、分析电镜、高压电镜 2.电镜样品制备技术： ①. 超薄切片术:样品固定→脱水→包埋(树脂)→超薄切片(约50nm厚)→捞于铜网上→染色(重金属盐) ②. 冷冻制样技术: ③. 负染色技术: ④. 真空镀膜技术: ⑤. 冷冻蚀刻技术:样品的液氮超低温冷冻→断裂→蚀刻(使断面的冰升华)→复型(喷涂铂与碳制作断面复型膜)→剥膜(腐蚀掉样品，剩下复型膜)→捞于铜网上→电镜观察 ⑥. 扫描电镜样品的制备技术:样品固定(锇酸、戊二醛、高锰酸钾等)→(临界状态下对样品进行)干燥→金属镀膜→电镜观察 四.扫描探针显微技术： 1.扫描探针显微镜(SPM)： 构成:①扫描装置 ②探针:不同类型的探针可测定样品表面不同属性 ③探针位移传感器:探测并调整探针与样品间距离 ④其它:计算机等 2.扫描探针显微镜应用： DNA研究:双螺旋图象和碱基对水平结构。 蛋白质研究:在溶液中(可保持蛋白质生理状态)观测蛋白质结构 生物膜研究:观察吸附在固体表面活溶液中的膜、膜表面蛋白或脂 质体结构及分布。 第二节.细胞化学技术 一.酶细胞化学技术： 以酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱。可检测水解酶、氧化酶、还原酶、裂解酶、合成酶和异构酶。步骤： 底物 + 酶 → 产物 + 捕捉剂 → 终产物（颜色、沉淀或电子密度高的物质） → 镜检 二.荧光细胞化学法： 依据某些物质（荧光色素）经紫外光照射后发荧光的特点，进行特异性显示。 三.免疫细胞化学技术： 免疫细胞化学(immunocytochemistry)利用免疫反应对组织或细胞的抗原分子进行形态定位的一种技术。 基本原理：利用抗原与抗体的特异性结合的特点，用标记过的已知抗体检测组织或细胞中相应抗原。 常用的标记方法有： 荧光标记： 酶标记： 铁蛋白标记： 胶体金标记： . 免疫细胞化学方法： ①.包埋法： ②.冷冻超薄切片法：标本快速冷冻固定→冷冻超薄切片→蔗糖冻融→PBS漂洗→免疫标记→甲基纤维素处理→干燥→电镜观察 四.放射自显影技术： 五.细胞显微分光光度测定技术： 细胞内的化学成分在自然状态下或化学反应染色后，均能吸收光谱的某一特定波段(230-700nm)如DNA对紫外光的最高吸收波段是260nm, 蛋白质的吸收波段是280nm。 显微分光光度术(microspectrophotometry)是显微镜技术和分光光度技术的结合，根据细胞内某些物质对光谱吸收的原理，定量测定一个细胞或细胞某一部分结构内化学成分。方法有紫外光显微分光光度法和可见光显微分光光度法(需对样品染色)。 第三节.细胞及其组分的分离纯化和分析 一.流式细胞技术(flowcytometry)： 用流式细胞仪(flowcytometer, FCM)分选或检测细胞及其组分的物理或化学特性的技术。 1.流式细胞仪的构成和工作原理： ①.细胞流动室： ②.光源和聚光装置： ③.信号检测器： ④.计算机系统： 2.样品的制备及应用： ①.细胞样品的制备:FCM适用于单个细胞或细胞组分样品的分析(将样品制成单细胞悬液)。 ②.细胞的固定和染色： ③.细胞的分选： 3.细胞分级分离： ①.差速离心法(differential centrifugation) ②.密度梯度离心法(density gradient centrifugation） ③.免疫磁珠(immu