c2807黑曲霉培养及分离纯化.docVIP

cccccc 黑曲霉的分离筛选 一、实验简介 黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉的最适温度为37℃，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状背面无色或中央略带黄褐色。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状。直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。硝酸钠 3g磷酸氢二钾 1g硫酸镁0.5g 氯化钾 0.5g硫酸亚铁 0.01g蔗糖 30g琼脂 20g蒸馏水 10002.1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。 2.2 熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。 2.3定容：将加热后的培养基导入量筒中，用自来水进行定容，至1000ml。 2.4 调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH边滴加边搅拌，使之达到pH5.0-6.0。若偏碱，则用1mol/L HCl调节。 2.5 分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，共20支。余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。 2.6 加塞、包扎、标记：试管加棉花塞，5支一捆包扎好，棉塞外加一层报纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用线绳扎成活结，；三角瓶用纱布塞住瓶口，并用牛皮纸的线绳包扎好。用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。 2.7 灭菌：0.1MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。 2.8 搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。 2.9 倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50℃左右，倒平板。 2.10 无菌检查：灭菌培养基放入37℃培养箱中一天，若无细菌污染则说明灭菌彻底。 3、菌种分离纯化 3.1 用接种环从黑曲霉孢子悬浮液，接种于小试管斜面中培养（5支）。然后放37℃培养箱中培养24小时。 3.2 平板划线：左手拿平板，右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约70度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线，依次作第三次、第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作连续划线。 培养：合上皿盖，倒置培养皿于37℃培养24小时。 挑菌落：挑取单个菌落的菌苔少许，涂在载玻片上进行显微镜个体形态观察，结合菌落形态特征综合分析。若不纯，需再用平板划线法继续进行分离纯化。 实验分析与检测 黑曲霉菌落特征 孢子呈圆球状，淡灰黑色，数目较多，清晰明显，个体较大。 菌落计数情况 培养平板 1 2 3 4 5 6 7 8 菌落数 18 20 16 5 13 17 9 24 菌落形态特征 第一天：直径约为5mm的菌落，扁平状，菌丝呈绒毛状，白色。 第二天：菌落变大，菌丝基部白色，顶部浅黄色。 第三天：菌落更大，菌丝基部浅黄色，顶部形成黑色球状形顶囊（即分生因子），菌丝密集，菌落呈现黑色。 结果分析 黑曲霉生长条件要求低，生长繁殖能力强，在平板上生长后，其他微生物难以生长繁殖，故黑曲霉较易实现扩大培养及分离纯化，对于利用黑曲霉进行工业发酵，如柠檬酸发酵具有一定意义。 实验存在的问题及建议 1、 在分装培养基时，注意不使培养基沾在瓶口或管壁上端浸湿棉塞，引起杂菌污染 2、接种、分离时，要在无菌环境下进行（靠近火焰），手不可触摸试管口端，以防烫伤，接种环不要碰触试管口边，防止污染。划线接种时，动作要轻，不要划破培养基