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RACE PCR 　　RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。　　cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 　　完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 　　末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。 　　RACE的优点 　　与筛库法相比较，有许多方面的优点 　　1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。 　　2）节约了实验所花费的经费和时间。 　　3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。 　　实验室现有的RACE试剂盒的简介 　　??RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。 　　??使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。 　　RACE引物的设计： 　　基因特异性引物（GSPs）应该是： 　　??23－28nt 　　??50－70％GC 　　??Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 　　需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。 　　反应中涉及到的一些事项 　　??cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。 　　??RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。 　　??在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。 　　??表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 　　??引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。 　　如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 　　??降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。 　　??验证基因特异性引物的对照： 　　??单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。 　　??利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。 　　??制备和抽提polyA+RNA 　　不要使用DEPC处理过的水。 　　纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小 　　具体的实验步骤 　　cDNA第一条链的合成： 　　??我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。 　　注意：在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。 　　将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。 　　直接进行第二链的合成。 　　??cDNA第二链的合成： 　　第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。 　　??建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。 　　??通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。 　　接头的连接及连接产物的稀释 　　??按照程序进行连接反应。 　　??如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTA buffer