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FluoroBeadsR分离T淋巴细胞和B淋巴细胞 发布: 2010-02-23 来自: 易生物实验 阅读数：7899次 【原理】 免疫磁性微珠表面联结着单克隆抗体的超顺磁性微珠。这些微珠在磁场中能够聚集在一起。当移去磁场时，这些磁珠不残留任何磁性。它们能再被磁化和分散。连接的单克隆抗体的特异性决定着结合细胞的类型。 分离T细胞 【原理】 T 荧光微珠提供了一个利用荧光染色进行型HLA 分型试验中分离T 淋巴细胞的简单的步骤。 T 荧光微珠是直径小于1 微米的免疫磁珠。抗CD2 单克隆抗体包被在微珠表面。CD2 抗体特异性吸附T 淋巴细胞上的E 花结受体。通过磁力架从血液中分离T 淋巴细胞／T 荧光微珠复合体。T 荧光磁珠方法不需要低温孵育、离心分离等步骤。 【注意】 人血液的使用必须严格按照操作步骤和实验室操作规范进行。用手接触标本可能会传染疾病。 【储存条件】 T 荧光微珠和T 荧光微珠显色剂要在2－5储存并在有效期前使用。不能冷冻。T 荧光微珠显色剂需避光保存。 【需要的材料和设备】 1.T 荧光微珠（FB1-25；FB1-40；FB1-100） 2.T 荧光微珠显色剂（FB1-DEV）（10×储存液）。工作液（1X），1 份储存液和9 份PBS 混合。 3.型组织分型板 4.FQAE（丫啶黄／溴化乙啶） 5.磁力架 6.1μL 与5μL 加样器 7.5mL 试管 0.磷酸盐缓冲液（PBS），无Ca++和Mg++盐类 0.吸管与吸头 【操作步骤】 （A） 样品采集 约需要2ml 的全血。抗凝剂首选ACD 或CPDA，也可以用肝素钠。不要使用肝素锂！T 细胞的分离要在24 小时内完成分离以得到最高产量，血液保存3 天内使用，血标本要水平放置在20－25储存。 （B） Ｔ淋巴细胞提取 方法一：从全血中分离 1、在5ml 的试管中放入2ml 血。 2、T 荧光微珠使用前彻底混悬，旋转约10 秒钟。 3、在待测样品中加入150μl 的T 荧光微珠。加盖反复颠倒2－3 次，使磁性微珠分散开。 4、在室温20－25轻轻的旋转3 分钟，让微珠附着到T 细胞上（不要超过4 分钟）。可以使用一种颠倒的装置或手动混匀。 5、加入2ml 稀释后的T 荧光微珠显色剂（工作液）。盖上盖子轻轻的颠倒2－3 次以混匀。 6、打开盖子并放到磁力架上3 分钟，不要超过4 分钟（本步骤为关键）。 7、用移液管移去上清液，移离磁力架。 8、用1－2mlPBS 清洗细胞（微珠）。轻击管子使微珠散开，再次将管子放到磁力架上1 分钟，移弃上清液。反复洗两次。 9、用0.5ml 的PBS 或含5％HIFCS 的McCoy’s 再次混悬细胞（微珠）。 方法二：从淋巴细胞分离液层（Ficoll 层）分离 1、以400－900g 离心已抗凝的全血。 2、收集白膜层并用等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，混匀。 3、在5ml 的管中最多加入2ml 的白膜层／PBS 混合液覆盖到1.5ml 的Ficoll－Hypaque（密度为1.077）层上，并以1000g 离心10 分钟。 4、从每个管中收集约1ml 的界面液体转移到炮弹管中。1000g 离心10 分钟。 5、弃去上清并用细胞培养液1640 再次使小球混悬。以1000g 离心5 分钟（移去大部分血小板。）弃去上清，用1ml 的20％的HIFCS／PBS 再次混悬细胞。 6、用吸液管移去上清，用1ml 的细胞培养液1640 再次混悬细胞。 7、加入100μl 的T 荧光微珠到样品管中。 8、在20－25旋混3 分钟。 9、去盖放在磁力架上1 分钟。 10、去上清并保存到另一个管中，用B 荧光微珠分离B 淋巴细胞。 11、1ml 细胞培养液1640 再次混悬细胞。轻击管子使得微珠再次混悬，放在磁力架上30 秒钟，用吸液管移去上清。重复2 次。 12、用0.5ml 的细胞培养液1640 再次混悬细胞（微珠）。 （C） 标记与调整细胞浓度 【FQAE 方法】 1、在泰萨奇板上的空白孔中加入1μl 的细胞（微珠）液。或在一张干净的玻片滴一滴细胞悬液。 2、加入5μl 的FQAE。或在一张干净的玻片滴一大滴FQAE。 3、用荧光显微镜计数。调整细胞浓度到2×106 ／ml（2000 个细胞／孔）。 【羧基二乙酰基荧光黄（CFDA）方法】 1、去盖放在磁力架上1 分钟，弃去上清。用PBS 混悬。重复两次。 2、加入0.5mlCFDA（工作液，pH5.5）并混匀。 3、在20－25避光孵育10 分钟。 4、重复步骤1。 5、用0.5ml 的含5％HIFCS 的McCoy’s 再次混悬细胞。 分离B细胞 【原理】 B 荧光微珠提供了一个在型HLA 分型试验中利用荧光染料分离B 淋巴细胞的简单的步骤在B 荧光微珠分离方法中，PBS/柠檬