Gateway反应体系.docVIP

文中如未特别指出，PCR程序均为：95℃预变性5,95℃变性30,60℃退火30, 72℃延伸130 (短片段30), 30个循环后延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 载体构建及鉴定 1．PCR产物的纯化 参见安比奥生物科技公司的Puprep PCR Purification Kit 说明书。 2. 载体构建（Gateway技术） pDONR201是包含筛选标记ccdB基因编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。当目的载体和入门克隆发生重组时，ccdB基因被目的基因取代。携带有ccdB基因的未反应载体或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长图2.2 图2.2 pDONR201的结构 BP反应体系 (attB x attP → attL x attR ) attB-PCR产物 40-100 fmol,25-50ng pDONR? 75ng 5x BP Clonase?- buffer 1 μl TE Buffer (pH 8.0) or H2O to 4.5μl BP Clonase? 0 .5μl Total 5μl 反应体系放于25°C下温育2h。反应后，加2 μl 2 μg/μl的Proteinase K在37°C下处理10 min，再将BP产物（入门载体）加2μl转入大肠杆菌DH5α，在含kan的LB板上筛选，克隆并保存入门载体。 LR反应体系 (attL x attR → attB x attP ) 入门载体 25-50ng 目的载体 75ng 5x LR Clonase? -buffer 1μl TE Buffer(pH 8.0) or H2O to 4.5 μl LR Clonase? 0.5μl Total 5 μl 体系放于25°C下温育2h，反应后，加2 μl 2 μg/μl的Proteinase K在37°C下处理10 min，再将2 μl反应产物（表达载体）转入大肠杆菌DH5α在含AmpLB板上筛选，克隆并保存入门载体。 3.质粒提取（安比奥试剂盒说明书） 将含有目的质粒的细菌接种到2-5ml的LB培养基中，37度培养12-16h,取菌液1.5-6ml于干净的1.5mlEP管中10000rpm 1min。 将细菌重悬于buffer 250ul PB1中（已加RNAase）,窝旋振荡，务必使细菌充分分散。 加入250ul buffer PB2 ,轻轻颠倒离心管4-6次。使溶液充分混允。使溶液澄清，一般反映不要超过5min。 加入350ul buffer NB3, 轻轻颠倒离心管4-6次。使溶液充分混允，静置3-5min. 14000rpm离心10min,将上清转移到含收集管的离心柱内。 1000-12000rpm 离心1min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。 加入0.5ml的buffer PB4于离心柱内，1000-12000rpm 离心1min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。 加入750ul的buffer WB于离心柱内, 1000-12000rpm 离心1min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。 重复8一次。 高速离心（13000-14000rpm）2min, 将离心柱盖子打开在室温下风干5-10min后置于一干净的1.5ml的离心管中。 加入50ul buffer EB或者是PCR水于离心柱的滤膜中央，静置1-3min,10000rpm，1min 则溶液里含有目的质粒。 将质粒置于-20度保存。 注意：buffer PB1 在用之前必须要加RNAase ，且要放在2-8度保存； buffer WB用前必须要加24ul无水乙醇。 4. 大肠杆菌感受态细胞的制备 取出保存于-80℃的菌种，用接种针挑取大肠杆菌在LB琼脂平板上划线，37 ℃培养 12-16h。 挑取一个单菌落接种于20mlLB液体培养基中，37℃培养过夜。 按照