食品专业基础实验指书-生物化学实验.docVIP

《食品质量与安全》 专业基础实验指导书 上海理工大学医疗器械与食品学院 实验实训中心 目录 课程名称：《生物化学实验指导》 实验名称：实验一 蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G250染色法 实验三 紫外吸收法测定核酸的含量 实验一 蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G250染色法 通过实验掌握蛋白质的定量测定方法。 预习要求： 要求预习实验讲义。 实验原理： 考马斯亮蓝G250测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。 实验设备与器材： 仪器 721型分光光度计、分析天平（万分之一）、量筒（100ml）、烧杯 250ml 、移液管 1ml, 5ml 、漏斗、漏斗架、容量瓶 100mL, 1000mL 、试管 试剂： 牛血清白蛋白 蛋白质标准溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为100μg/mL的蛋白溶液。 考马斯亮蓝G250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85％的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在室温下可放置1个月。 95％乙醇溶液 85％磷酸 实验内容与步骤： 1、标准曲线绘制 取6支试管，按下表加入各试剂。 管号 0 1 2 3 4 5 100μg/ml蛋白标准液／mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水／mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝液／mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。 以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。 2、样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取待测蛋白样液0.5mL放入试管中，加入蒸馏水0.5mL混匀后，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量，以蒸馏水作空白样。 3、结果计算 样品中蛋白质含量（μg/g鲜重）＝C×离心后的体积（mL）/样品鲜重（g） 式中C为在标准曲线上查得的蛋白质浓度（μg/mL） 【注意事项】? （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。 （2） 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 思考题： 1. 除了考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量外，还学过哪些方法可测定蛋白质含量，这些方法各有何优缺点？ 实验二 蛋白质的两性性质及等电点的测定 实验目的： （1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。 （2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。 要求预习实验讲义。 实验原理： 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端α氨基与C端α羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团，他们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡： 阳离子 两性离子 阴离子 pH pI pH pI pH pI 电场中： 移向阴极 不移动 移向阳极 调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。 仪器： 试管架，试管：15ml×6，刻度吸管：1ml×4，2ml×4，10ml×2，胶头吸管×2 试剂 1、 1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml。 0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。 0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。 0.2mol/LNaOH：称取NaOH2.000g，加水至