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工具酶
工具酶 内容提要 第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA 连接酶 第三节 DNA聚合酶 (聚合酶 I /Taq聚合酶 /反转录酶) 第一节 限制性核酸内切酶 Restriction endonuclease (RE) 一、限制性核酸内切酶的概念 二、限制性内切酶的命名 三、限制性内切酶的类型 四、影响限制性酶活性的因素 五、限制性内切酶对DNA的消化 一、概念 1. 定义 是一类能够识别双链DNA中的特定核苷酸序列,并在特定位点切割双链DNA的内切酶。 2. 来源 细菌的限制性内切酶。 3. 功能 (1) 限制 Restriction 侵入细菌体内的外源DNA(非甲基化),能被限制性内切酶识别和降解,从而保护自身的DNA不被降解。 图 细菌的限制系统 (2) 修饰 Modification 细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰,从而防止限制性内切酶的识别和水解。 ① Dam甲基化酶 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。 图 细菌的修饰系统 图 甲基化位点:DNA上的 A/C 二、限制性内切酶的命名 1973年Smith等提出酶的命名原则。 用属名的第一个字母和种名的头两个字母,表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示。用一个大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一宿主菌内,如有不同的限制酶,用罗马字母表示。如EcoR I。 限制酶的命名 图 几种重要的限制酶 图 几种限制酶的识别位点 三、限制性内切酶的分类 分为I 型、II型和III型。 1. I 型限制性内切酶 1968年,首先由M. Meselson和R. Yuan在大肠杆菌 B株和 K株分离。如 EcoB和 EcoK。 (1)识别序列 未甲基化修饰的特异序列: (2)切割位点 切点距离识别位点约400~7000 bp。不在识别位点。随机切开一条单链。 如一条DNA链甲基化,就行使甲基化酶功能,使另一条链甲基化。 如两条链已甲基化,酶从DNA链解离。 需ATP、Mg2+ 和S-腺苷甲硫氨酸。 2. III 型限制性内切酶 与I型酶有甲基化功能。 能在DNA链上的特异位点切割。 其切割位点在识别位点以外。 反应需要ATP、 Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。 基因工程中用途不大。 如EcoP15: CAGCAG------? 3. II型限制性内切酶 1970年,H.O. Smith和K.W. Wilcox首先从流感嗜血菌中分离出HindⅡ 。 (1)识别序列与特点 双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。 识别序列长度4 ~ 8 bp。 多数是回文结构。II s型除外。 (2)酶切位点 在识别位点处,切开双链DNA,形成粘性末端或平齐末端。 图 Ⅱ类酶识别序列特点:回文序列 (3) 平齐末端 blunt end EcoR V :产生平齐末端。 5’-GAT?ATC-3’ 3’-CTA?TAG-5’ (4) 粘性末端 sticky end 含有几个核苷酸的单链末端。 ① 5′端突出 EcoR I :形成5’-粘性末端。 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ ② 3′端突出 Pst I :形成3’-粘性末端。 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ ③粘性末端的意义 连接方便 不同的DNA双链:只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。 同一个DNA分子内连接:通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 图 粘性末端连接 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等)造成人工粘性末端。 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 四、同裂酶 Isoschizomers 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶 识别序列相同和切点相同。 ② 不完全同裂酶 识别序列相同,但切点不同。 五、同尾酶 Isocaudamers 1. 定义 识别序列不同,但能切出相同的粘性末端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I等为同尾酶。 2. 特点 同尾酶的粘性末端互相结合后,形成的新位点,不能再被原来的酶所识别。 六、限制酶的活性 限制性内切酶的识别和酶切活性,只有在最适条件下,才表现出最大酶切能力和位点专一性。 1. 活性的定义 在适当反应条件下,1小时内完全酶解1?g特定DNA底物,所需要的限制性内切酶的量,为一个活性单位。 2. 星号活性(*) 星号活性: 改变反应条件,导致限制酶的专一性和切割效率的改变。 如EcoR
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