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登革热IgG ELISA试剂盒 （德国IBL RE58671） 1、前言说明： 登革热病毒是一种直径大约为50nm的单链RNA病毒，属于黄病毒类。登革热和登革热出血性高烧是由四种紧密联系但抗原性截然不同的四种血清型病毒（登革热1、登革热2、登革热3和登革热4）中的一种所引起的。感染其中一种血清型并不会产生交叉保护免疫，所以居住在登革热流行区域的人在其一生中将会有四种登革热感染。登革热病毒通过埃及斑蚊传播，它是一种喜欢在白天叮咬人的蚊子。登革热病毒感染产生的临床疾病的波及范围是：非特异性病毒综合征到严重或致命性的出血性登革热。登革热是一种主要的热带疾病；它在全球的分布与疟疾相当，全球大约有25亿人处于登革热流行高危区。全世界大约有500到1000万登革热高烧病例，几百或几千登革热出血性高烧病例。 登革热出血性高烧的死亡率大约为5%；这些死亡的病例大多数是儿童和年轻人。 登革热出血性高烧的重要危险因子包括感染病毒的种类和血清型，也包括病人的年龄、免疫状态和是否为遗传性的易患病体质。 危险人群：热带城市的居民或游客。 物种 疾病 症状 感染机制 登革热病毒 登革热 登革热出血性高烧 或称碎骨热 一开始就发烧，严重头疼，肌肉疼痛， 关节痛，白细胞减少症，血小板减少症 出血现象。 通过蚊虫传播（埃及斑蚊） 登革热病毒的相关感染可通过如下方法来鉴别： 血清学：用ELISA检测抗体 登革热病毒感染可产生终生免疫，但不同的抗原血清型并不能提供交叉保护免疫，所以理论上，人一生能经理四种不同的登革热感染；并得不到登革热疫苗。 2、应用范围 登革热病毒IgG ELISA试剂盒可用于人血清中抗登革热病毒IgG抗体的定性检测。 3、实验原理 抗登革热病毒IgG抗体的定性酶免检测利用的ELISA技术。包被板上预先包被了结合样品相关抗体的登革热病毒2型抗原。洗板除去未结合的样品物质后，加入辣根过氧酶标记的抗人IgG酶联物。这一酶联物可与捕获到的登革热病毒特异性抗体结合。加入能产生蓝色反应产物的TMB底物液后，如果显示蓝色则可知已形成免疫复合物。所显示颜色的强度与样品中登革热病毒特异性IgG抗体的量成正比。加入硫酸以终止反应,以便产生黄色的终点颜色。用一酶标仪在450m处读取OD值。 4、材料 4.1所提供的试剂 登革热病毒包被板（IgG）：12×8可拆板条，包被有登革热2型抗原，真空密封于铝铂μl和100μl） 旋涡混合器 去离子水或双蒸水 试管 计时器 5、实验步骤 实验开始之前仔细阅读操作步骤，严格遵守操作步骤才可以获得可靠的实验结果。如果这实验是在ELISA自动系统上进行，为了避免洗板的影响，我建议在洗板步骤时，洗板3次改成洗板5次，洗涤液从300μl增加到350μl。实验开始之前，应当在试剂盒提供的结果单上标记好所有的样品和质控品。取适当数量的板条置于板架上。 请至少做以下几个孔： 1孔（例A1）做空白对照孔 1孔（例B1）做阴性质控 2孔（例C1+ D1）做临界质控 1孔（例E1）做阳性质控 我们建议您将质控和病人样品做双份检测。照说明书给出的实验步骤进行操作，并避免不同步骤之间的时间隔无明显差别。加每一质控品和样品时都应当用新的取样吸头。把恒温箱调至37 ± 1℃ 1）控品和已稀释好的样品分别100μl加入到相应的微孔中，留下A1做空白对照孔。 2）盖板。 3）37±1℃下温育1h±5min 4）温育后，移去粘性金属板，弃取孔内反应液，用300μl洗涤液洗板3次。避免反应孔中的液体溅出。每次洗板间的浸润时间都应大于5秒。最后在吸水纸上拍干。 注意：洗板步骤很重要，洗板不充分将可能导致结果不精确或错误的OD值。 5）除空白孔外，在每一微孔中都加入100μl登革热抗IgG酶标物，盖板。 6）37±1℃下温育30±2min，避免太阳直射 7）重复步骤4 8）在每一微孔中加入100μlTMB底物液 9）室温下（20-25℃）避光温育30min 10）按加TMB底物液的顺序和速度在每一微孔中加入100μl终止液。 温育之后，包被板内试剂的颜色由蓝色变为黄色 注意：高阳性的病人样品会引起染色剂沉淀。这些沉淀物会影响OD值的读取。例如：我们建议按1：1的比例用生理盐水预先稀释样品。然后按1：100的比例用稀释液稀释样品，并将结果乘以2。 加终止液后30min之内在450/620nm处读取OD值。 6、结果 6.1实验有效标准 为了使每次检验都是有效的，必须满足以下标准： 空白对照孔A1：OD值应小于0.100 阴性质控B1：OD值应小于0.200 临界质控C1和D1：OD值应当在0.250和0.900之间 阳性对照E1：OD值应当等于或高于临界值 6.2结果计算 临界值是临界质控的平均OD值 例如：临界质控OD值0.49+临界质控OD值0.47 0