WesternBlot实验计划完整版.docVIP

Western Blot 实验计划完整版 一、SDS 1、分离胶的配制 10% 10% 30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 2.67 mL 4.005mL 去离子水 3.33 mL 4.995mL 分离胶缓冲液(4X) 2.00 mL 3.00mL 8.00 mL 12.00mL 10%(w/v)APS(现用现配) 45μL 67.5μL TEMED 12μL 18μL 2、压缩胶的配制 3% 30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 0.75 mL 去离子水 3.00 mL 压缩胶缓冲液(4X) 1.25 mL 5.00 mL 10%(w/v)APS(现用现配) 30μL TEMED 8μL 先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在20~40min内使用。 3、蛋白样品的制备 蛋白样品 8μL 上样缓冲液(loading buffer/laemmili buffer) 12μL 煮沸5min 冷却至室温 短暂离心 之后可加样，加样孔的深度至少为5~8mm。 拔出梳子后，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除 从烧水开始，蛋白样品的制备大约需要35min 4、电泳 压缩胶电压：80V（10mA） 分离胶电压：120V（20mA） 当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳。 5、染色 考马斯亮蓝染色液35min，摇床摇动（为获得最大分辨率，5%凝胶染色2小时，10%凝胶染色4小时） 用清水反复漂洗几次 高甲醇脱色液25min，摇床摇动（也可用7%（v/v）冰乙酸） 低甲醇脱色液，摇床摇动 二、Western blot 1、润湿 准备6张Whatman 3#滤纸、一张硝酸纤维素膜，尺寸与凝胶大小相仿，先放入水中3分钟，放入转膜缓冲液中5分钟。 2、起胶 将凝胶从电泳槽中取出，放入转膜缓冲液中10分钟 3、三明治的制作 按以下顺序放置：3层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层Whatman 3#滤纸 切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。 4、海绵的润湿 用转膜缓冲液将海绵润湿 5、转膜 将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。 For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH). For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH). For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS). For Proteins larger than 25