十项必修技能操作步骤.docVIP

仅供参考，具体以各实习指导老师要求以及考核大纲为准！ 1、质粒DNA提取 实验用品：试剂盒，Ep管，离心机，恒温箱，菌液 流程： 1.将小管中的菌液分批次倒入对应编号的Ep管中，离心13,000rpm ，2min ，弃上清（最后一次在纸上扣干） 2.加250ul预冷的solution I（RNA酶），涡旋振荡混匀（内置200ul枪头），使细胞尽量分散 3.加250ul solution II，盖紧管口，快速上下颠倒10次以上 4.加250ul solution III（2min内），盖紧管口，快速上下颠倒10次以上，离心13,000rpm 10min，取上清（不可吸到絮状沉淀） 5.上清置于对应编号的离心柱，下接集中管，离心10，000×g 1min（可重复一次，提高DNA量，即集中管液倒回离心柱） 6..弃集中管液，加HB 50ul离心10，000g 1min（可重复一次） 7.弃集中管液，加Wash Buffer 700ul（用前加无水乙醇）离心10，000g 1min（可重复一次） 8.弃集中管液，空柱离心13，000g 2min 9.加Elution Buffer 50ul ,下接标记好的Ep管，盖上离心柱的盖子 60℃， 温育10min,离心13，000g 2min 检测： 1%~1.2%的Agarose gel检测 2、组织/细胞RNA提取（Trizol法） 实验用品： 试剂：Trizol 试剂、无水乙醇、DEPC水、氯仿、异丙醇、液氮 物品：冰、灭菌玻璃试管、组织匀浆器、移液器与枪头、1.5ml Ep管、高速离心机、滤纸、Ep管架、timer、振荡器 注意事项：①RNA易被空气中的RNA酶降解，②提取过程中注意污染 实验步骤： 1.准备冰盒，取N支无菌玻璃试管，依次标记后插在冰盒中，每管加入1 ml Trizol 试剂，另取2支试管加入氯仿。 2.准备液氮罐，快速取出需要提取的组织冻存管放入其中。 3,取出N个Ep管，分别对应玻璃管双标记。 4.将组织匀浆器接好电源。 5.分别取各冻存管中的组织放入对应的无菌玻璃管中。 6.清洗组织匀浆器工作头。之后开始匀浆，一般匀3~5次，每次匀5~8秒，放于冰上约10 秒，再匀下一组织，所有组织匀完之后，洗净晾干，收好匀浆器。 7.最后一次组织匀完之后，计时5min ，静置匀浆的组织。 8.将玻璃试管中的组织倒入对应标记好的1.5ml Ep管中。 9.各管加入200 ul氯仿，盖好Ep管盖，两试管架紧扣Ep管，用力晃动约15s，室温孵育3min，然后4℃,12000×g 离心15min。 在此期间再标记一套新的Ep管。 10.缓慢吸取上层水相500 ul，转移至新标记的Ep管中，各加入200 ul氯仿，盖好Ep管盖，两试管架紧扣Ep管，用力晃动约15s，室温孵育3min，然后4℃,12000×g 离心15min。 再取一套灭菌的Ep管，与前面同样标记。 11.小心吸取上清液约500 ul（如果上清液不多，可以不吸够500 ul），放入对应标记的新管中。 12.各管加入500 ul异丙醇，振荡器混匀，室温孵育10 min，4℃,12000×g 离心10min。 13.吸去上清，各管加入75%乙醇in DEPC 1ml，振荡器混匀，4℃,17500×g 离心5min。 14.倒去上清，于滤纸上扣吸片刻，4℃，7500×g 离心1min，用移液枪吸去剩余上清，空气干燥约2min。 15.各管加入适量DEPC水，混匀溶解ＲＮＡ，将各管置于冰上，以备检测。 注：提取细胞RNA的过程与提取组织的是一样的，只是不需要匀浆的过程 3、普通PCR扩增 体系： 原始浓度 终浓度 10*buffer 10× 1× Mg2+（buffer中有就不加） 25mM 1.5mM dNTP 2.5mM/each或2mM/each 200um/each template 2pg-1ug Primer 100um 1um enzyme 5U/ul 1-5U ddH2O 补足体系 扩增条件：变性—退火—延伸，根据需要设置时间，变性温度一般固定，退火温度根据Tm值确定，延伸温度根据酶的性质决定，延伸时间与片段大小以及酶的效率有关 4、琼脂糖凝胶电泳检测核酸 步骤： 1.根据需要的凝胶的浓度，计算所需琼脂糖的质量。 2.称量所需琼脂糖，加入对应体积的1×TAE。 3.微波炉加热溶解完全，即没有细小的颗粒产生为止。 4.冷却至60℃左右（不烫手），加入核酸染料，摇匀，倒入制胶槽中。 5.待胶凝固后即可点样。 6.将样品与6×loading（工作浓度1×）混合后加入点样孔中，调合适电压电泳。 7.电泳结束后放在紫外仪或凝胶成像系统中观察。 5、质粒/PCR产物的双酶切、连接 双酶切：