第十五章：酵母菌基因工程解析.ppt

利用上述细胞类型决定簇的两种特异性突变基因可以构建对克隆的外源基因表达进行温度控制的二元系统 ： 温度敏感型突变体sir3-8ts。 α2蛋白的突变体hmlα2-102---导致它在与a1蛋白交配时对MATα顺反子阻遏活性的丧失，但仍保留a-特异性基因的能力。 因此具有MATa-hmlα2-102-HMRa-sir3-8ts基因型的酵母细胞在25℃培养时，应具有a交配类型，因为此时只有MATa基因能表达，hmlα2-102和HMRa均为Sir蛋白所阻遏。 附加体型质粒载体YEP及其构建 由大肠杆菌质粒、2u质粒以及酵母染色体的选择标记构成。 2u质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。 对酵母基因很高的转化活性，比YRP型载体更稳定，拷贝数也高，是基因克隆中的常用载体。 YEp13质粒 载体PYF92： 酵母的2μ质粒 pBR322质粒 酵母的His+基因 酵母人工染色体载体（ YAC ） YAC 载体是由酵母染色体中分离出来的 DNA 复制起始序列、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体。 YAC 载体是以质粒的形式出现，长度约 11.4kb ，带有人工染色体所需的一切元件。每个 YAC 载体可以装进 100 万碱基以上的大片段 DNA ，比柯斯质粒的装载能力要大得多。 复制元件：YAC 载体的复制元件是其核心组成成分 自主复制序列 用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 两个端粒 标记基因：主要采用营养缺陷型基因，Trp+、Leu+、His+、Ura+等 第四节、酵母菌的转化系统 酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因 酵母菌的转化程序 酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。 酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率高达105转化子/μgDNA。 酵母菌电击转化 转化质粒在酵母细胞中的命运 单双链DNA均可高效转化酵母菌，但单链DNA的转化率是双链的10~30倍。 含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对于体内定点突变酵母基因组极为有利。 同源重组的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组之间的同源程度以及同源区域长度，一般来说，整合子占转化子总数的50~80%。 用于转化子筛选的标记基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因： 营养缺陷型互补基因 显性基因 营养缺陷型的互补基因 营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成基因如：Leu 、Trp、 His、 Lys、 Ura 、Ade。 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。 显性标记基因 显性标记基因的编码产物 标记基因 编码产物 遗传表型 Aph 氨基糖苷转移酶 抗G418 Cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素 Dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 Cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子 Suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖 Ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂 第五节、酵母菌的表达系统 酵母菌启动子的基本特征和选择 用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌Ⅱ型启动子的特征： 基本区 调控区 TATA盒 转录起始位点。 上游激活系列（UAS） 上游阻遏序列（URS） 利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子； 从已有的启动子中构建杂合启动子。 利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，所使用的无启动子报告基因为疱疹单纯病毒的胸腺嘧啶激酶基因（HSV1-TK）。 Thd + ATP → TMP + ADP TK 利用氨甲喋呤和对氨基苯磺酰胺抑制其dTMP的生物合成。 将HSV1-TK基因与pJDB207重组构建一个启动子探针质粒，在TK基因上游的单一限制性酶切口处插入随机断裂的酵母菌基因组DNA片段，从含有氨甲喋呤、对氨基苯磺酰胺以胸腺嘧啶的选择培养基上即可获得含有启动子活性片段的阳性转化子。 将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子。ADH