外周血细胞染色体培养操作.docVIP

实验六 人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 实验目的 1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。 2、初步掌握人外周血淋巴染色体的制备技术。 实验用品 1、器材：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（附照相装置）、隔水式恒温培养箱、干燥箱、水平式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸气消毒锅、真空泵（或电动吸引器）、10ml刻度离心管、10ml培养瓶（可用环磷酰胺药瓶代）、2ml注射器、吸管、滴管、试管架、三角烧瓶、染色缸、酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷盘、铝制饭盒、消毒用酒精棉球与碘酒棉球等。 2、材料：人外周血 3、试剂：RPMI l640培养液（含10~20％小牛血清）、碳酸氢钠（AR）、PHA、青霉素、链霉素、肝素、5％NaHCO3溶液、1mol／L HCl、三蒸水或双蒸水、0.075 mol／L KCl、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液，pH6.8的磷酸缓冲液。 实验原理 据测定，健康成年人体内的淋巴细胞总数约有500×109，其中约有2％在外周血中循环。在外周血的淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主（每毫升血中的含量可达1~3×106个）。在通常情况下，它们都处于间期的G0或G1期，所以很难见到正在分裂的淋巴细胞。但是，Nowell（1960）发现，从芸豆（phaseolus vulgaris）中提取的能使红细胞凝集的物质一植物血球凝集素（phytohemagglutinin，PHA）可以刺激淋巴细胞进行有丝分裂。在PHA的作用下，处在G0期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂，当体外培养至72小时左右时，大多数淋巴细胞已处于第二增殖周期内，此时用有丝分裂的阻断剂秋水仙素（colchicine）处理细胞可使正在分裂的细胞都停止在中期，再经低渗、固定等处理，便可得到较多可供分析的中期染色体。 以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方便，用血量少（0.3～1.0ml即可），培养简单等优点，故该方法在临床上已得到广泛的应用。 内容与方法 一、器材的清洗 1、培养用瓶的清洗；将培养瓶放入肥皂水中煮沸30分钟，并趁热刷洗瓶内，然后用自来水将皂液冲净，干后置硫酸一重铬酸钾洗液中浸泡24小时左右，从洗液中取出的小瓶立即用自来水充分冲洗15次，接着用蒸馏水冲洗5次，双蒸水冲洗3次，然后将小瓶倒立在铝饭盒中，置于烤箱将其烤干，最后盖上饭盒盖放入高压蒸气消毒锅中灭菌。其它玻璃器皿的清洗消毒与上述操作基本相同． 2、玻璃除菌滤器的清洗；新购置的玻璃除菌滤器先用肥皂水刷洗并用自来水冲洗干净；再将滤器安置在抽滤瓶上，倒满浓硫酸后进行抽滤，使浓硫酸全部通过滤板，然后用蒸馏水多次抽滤，使残留的酸全部除去，再用双蒸水滤过两次，置110℃烤箱中2小时（温度不要过高；以免使玻璃析出碱性物质）；取出后用牛皮纸包扎出入口置高压蒸气消毒锅中灭菌。抽滤过不含血清的培养液的滤器可直接用蒸馏水抽滤洗涤。但抽滤过血清或PHA的滤器必须用浓硫酸浸泡一天（将滤器中盛满浓硫酸，不加负压）后，再将剩余的硫酸抽完，然后用蒸馏水彻底冲洗。 3、橡胶瓶盖的清洗：橡皮塞清洗较简单；可直接放入肥皂水中煮沸30分钟，然后用自来水充分冲洗， 再用蒸溜水煮沸30分钟，取出后用蒸馏水、双蒸水、各冲洗两次，放入100℃烤箱中烘干，置饭盒中；高压灭菌备用。 4、载波片的清洗：新载玻片先用肥皂水逐一洗一遍，用自来水彻底冲洗干净，再逐一投入到95％的酒精中浸泡一夜（可在其中长期保存），用前一小时捞出，然后放入蒸馏水中置入冰箱预冷。 二、人微量外周血淋巴细胞培养 1、采血：用2.5ml一次性注射器抽取肝素使用液0.2ml；湿润针管，然后将多余的肝素排除。常规消毒被检查者肘部皮肤，从肘部静脉采血1毫升。 2、接种：在无菌室或超净工作台内按无菌操作将抽得的抗凝血分装于2个含培养液的培养瓶中（可将针头直接插入培养瓶的橡皮塞注入血液0.3～0.5 ml）。轻轻摇匀。 3、培养：将接种了人血的培养瓶放入隔水式恒温培养箱中，37℃培养72小时。 三、染色体标本的制备 l、秋水仙素处理：在收获细胞前3～4小时用lml注射器（装5号针头）加入浓度为5μg／ml的秋水仙素2滴，使培养液中的秋水仙素终浓度为0.05μg／ml。轻轻摇匀，放回培养箱中继续培养3~4小时。 2、终止培养（收获细胞）：取出培养瓶，用吸管将培养物混匀，并移至10ml刻度离心管内，平衡后放入离心机，以1000r／min离心8～10分钟，吸弃上清液。 3、低渗处理：往离心管中加入8ml 预温至37℃ 的0.075mol／L的KCl，用吸管混合均匀，置37℃恒温水浴箱中低渗25～30分钟（精确的低渗时间应自行摸索） 4、固定： ①预固定：低渗处理完成后，加入lml新配制的固定液并混合均匀，放入离心机，以