实习十家兔精液的冷冻保存.docVIP

实习十 家兔精液的冷冻保存 一、目的 掌握家兔精液冷冻保存的原理，熟悉家兔精液冷冻保存的程序和方法。 二、材料 1．仪器 分析天平，液氯罐，冰箱，离心机，磁力搅拌器，烧杯，量筒，玻璃棒，注射器，广口冷藏瓶。 2．药品 葡萄糖，蒸馏水，磷酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸，二甲基亚砜，新鲜鸡蛋，青、链霉素，甘油。 三、方法与步骤 一 冲洗涤、洗涤液和保护液的配制 1．冲洗液的配制 冲洗液为洗涤各种器皿所用。具体配制方法如下：用分析天平称取无水葡萄糖5．5lg，放人量筒中，加蒸馏水至100m1处，充分溶解．过滤，消毒，密封保存。 2．洗涤液的配制 洗涤液为洗涤精子用。具体配制方法为：用分析天平称取无水葡萄糖7．6g．放人量筒中，加蒸馏水至100ml处，充分溶解，过滤，消毒，密封保存。 3．保护液的配制 保护液为冷冻时保护精子用。具体配制方法为：用分析量筒取磷酸缓冲液79m1 NaH2矾012H205．4638、Nd2N4．2K201．5208配成0．25mol／L pH7．00的缓冲液 放入量筒中，再用分析天平称取无水葡萄糖5．76g，三经甲基氨基甲烷0．48g，柠檬酸0．25g，混合溶解于缓冲液中，过滤、消毒后冷却至25℃时加入甘油2．00ml,二 甲基亚砜4．00m1．新鲜卵黄15ml，青、链霉素各l0万IU，于磁力搅拌器上搅拌30~ 40min。 pH要求在6．95~7．05。 二 采精及精液品质检查 1，采精 略 2．精液品质检查 在检精室内进行射精量、胶体数量、颜色、密度，活力，PH常规检查。精子活力在0．6以上、每毫升精子数在l亿以上的精液．方可进行冷冻。 三 精液的洗涤与浓缩 1．按射精量1：1缓慢加入等温的洗涤液，洗涤精液。 2．将洗涤后的精液分装在离心管中，等量对称放人离心机中（室温18~25℃环境中 操作 。 3．采取变速上档迅速退档的方法,即500r/min2min,1000r／min2min,1500r／min3min，2000r/min3min,2500r/min7min,然后迅速退档。 4．离心机停后，取出离心管，倾出上精液。检查上清液，以无精子为最佳。 四 稀释与分装 1．用自来水→蒸馏水→冲洗液三次冲洗安领瓶。 2．按预计的稀释倍数．将等温的保护液加入到精子粥中，慢慢晃动，使精子浮游起来。 3．用1~5m1注射器吸取稀释后的精液分装到安额中，每文剂量0.5m1。 玉 降温与平衡 1．将盛有精液的安领用4层毛巾包裹，故在装有适量冰块的铝盒中，移人冰箱，使其逐渐降温。由30~25℃降至9℃需45min 有冰 ；由9℃降至5℃亦需45min 无冰 2．平衡由5℃维持或降至0℃，需90min。 六 冷冻 1．取少许液氯缓慢倒入广口冷藏瓶中预冷，然后再将液氮逐渐加至冷藏瓶的l/2处。 2．将特制的提斗放入冷藏瓶中预冷后，固定在特制的升降架上，使提斗的底部与液氮面相距约0．5~1cm，处于熏蒸程度。 3．将降温平衡后的安瓶从冰箱中取出，故人装有冰块的塑料杯中，以10~20s的速度将精液转移到液氮面上的提斗中进行初冻。 4．精液安瓶在提斗中熏蒸4—5min后即可听到冻裂声。冻裂声由弱→强→弱，当声音消失1—2min后，即表示冻结完好 大约8~l0min 。然后格提斗中的精液安甜迅速浸入液氮中，深冻2—3min。 七 储存 将冻结好的精液安瓶从广口冷藏瓶中转移至液氮罐中的储精提斗或纱布袋巾，沉浸在液氯中，即可长期储存。 四、作业 1、简述家兔精液冷冻保存的原理。 2、简述家兔精液冷冻保存的方法。