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罗田板栗玫瑰红栗实内生细菌的分离鉴定 　　摘要：为了探明罗田板栗新品系玫瑰红耐贮藏的内在原因，评价其栗实中的内生细菌资源，用组织分离培养法从栗实中分离其内生细菌，并通过比对结构、生理生化特征及16S rDNA序列分析等方法对所分离的内生细菌进行鉴定。结果从玫瑰红板栗栗实中分离得到2株内生细菌FR1和FR2，经鉴定为水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。 　　关键词：罗田板栗；玫瑰红；内生细菌；分离鉴定；16S rDNA 　　中图分类号：S664.2；Q948.122.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）04-0806-03 　　Isolation and Identification of the Endophytic Bacteria from Castanea mollissima ‘Meiguihong’ of Luotian County 　　LI Lin-ling，HUA Juan，CHENG Hua，LIAO Zhi-qin，WANG Yu-ping，YUAN Hong-hui，CHENG Shui-yuan 　　（Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratories， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China） 　　Abstract： In order to explore the storage tolerance mechanism of Castanea mollissima Blume. ‘Meiguihong’， a new variety of chestnut from Luotian， and the resources of endophytic bacteria were evaulated from its chestnut. Two kinds of pathogenic bacterium， FR1 and FR2， were isolated from the decayed seeds of Chinese chestnut. These two strains were preliminarily identified as Rahnella aquatilis and Bacillus licheniformis by comparing structure， characteristics of biochemistry and physiology， sequence of 16S rDNA. 　　Key words： chestnut of Luotian； Meiguihong； endophytic bacteria； isolation and identification； 16S rDNA 　　板栗（Castanea mollissima Blume）俗称栗子，营养丰富，风味较佳，是重要的干果品种，中国板栗的栽培面积和总产量均居世界首位。板栗对山区经济发展和出口创汇具有重要意义。但由于其含水量高的特点，贮藏期易发生栗实腐烂，腐烂率甚至可高达50%，严重制约了板栗产业的发展[1]。栗实腐烂的发生机理及绿色防治逐渐成为研究热点[2-5]。 　　内生菌（Endophyte）是指在生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部，且被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症的真菌或细菌[6]。这些内生菌对宿主植物的生长发育、抗逆性、抗虫性及抗病性方面均有重要作用，在农业生产、化工制药、卫生保健等方面有巨大的潜力[6，7]。研究者已在棉花、玉米、甜菜、烟草和黄瓜等多种作物体内分离筛选到具有防病或诱导抗病的内生真菌和细菌[6-10]，但关于板栗栗实内生细菌资源的研究鲜见报道。试验以新培育的耐贮藏南方板栗――罗田板栗新品系玫瑰红栗实为研究对象，采用组织分离法分离，并利用16S rDNA序列分析和形态、生理生化相结合的方法鉴定其内生细菌，以期为筛选抗栗实腐烂的拮抗细菌及开发生防保鲜剂奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 板栗果实 板栗品系为玫瑰红，采摘于湖北省罗田县胜利镇，去苞壳后得到栗实。 　　1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.2。 　　1.1.3 主要试剂 克隆载体pMD18