污水处理厂耐β―内酰胺类乳糖发酵型肠杆菌Ⅰ类整合子及基因盒研究.docVIP

污水处理厂耐β―内酰胺类乳糖发酵型肠杆菌Ⅰ类整合子及基因盒研究 　　摘 要：该文首先用 PCR等方法，对闵行污水处理厂分离的β-内酰胺类抗性菌株中Ⅰ类整合子和基因盒的存在情况进行测定；其次，对含有Ⅰ类整合子-基因盒的抗性菌株抽提质粒，分析Ⅰ类整合子-基因盒所在位置；最后，探讨了含有整合子-基因盒菌株对多种抗生素的反应。 　　关键词：β-内酰胺类抗性菌株；Ⅰ类整合子；基因盒 　　中图分类号 X703 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）07-15-03 　　Abstract：In this paper，PCR techniques were used to detect the presence of classⅠintegron and gene β-lactam antibiotics which selected from sewage water samples. Second，the plasmid DNA were extracted from β-lactam resistant strains with classⅠintegron and gene cassette，which detected the position of classⅠintegron and gene cassette. Finally，the response of a strain containing classⅠintegron and gene cassette to antibiotics were investigated. 　　Key words：β-lactam antibiotics；ClassⅠintegron；Gene cassettes. 　　1 前言 　　随着抗生素使用越来越频繁，细菌具有了更强的抗药性，从而使耐药性广泛传播。耐药基因的水平传播主要由质粒、转座子、噬菌体介导，而整合子起着至关作用[1]。Stokes[2]在1989年首次提出了整合子的概念，Hall[3]在1991年正式提出了基因盒-整合子系统的概念。整合子是细菌DNA片段，与细菌耐药性密切相关[4]，是一种存在于细菌质粒或染色体上的遗传元件系统，通过自身编码的整合酶来获取外源基因并使之表达。 　　整合子由5′-保守末端（CS）、3′-保守末端及位于2段保守序列之间的可变区组成，它能够捕获、整合及表达耐药基因。5′-CS是整合子的基本结构，包括一个编码整合酶的IntⅠ基因、一个整合子重组位点attI和启动子（Pant）[5]。中间可变区域有不同种类和数量的耐药基因盒，表现出多耐药特征。而基因盒是一种结构比较小的、自己无法转录翻译，需要借助外界力量来帮助自己表达，而整合子经常是它的首选目标。基因盒通过整合子上整合酶被整合到整合子中或从整合子里被剪切下来，使耐药基因得以传播与扩散[6]。3-CS的结构因整合子种类而不同。 　　到目前为止，Ⅰ类整合子是研究最多也是被检测到最多的。Ⅰ类整合子的5′-CS部分一般相似，而3′-CS存在差异。多数3′-保守端有3个开放的基因读码框：磺胺耐药基因（SulⅠ），季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因（qacE△1），以及功能尚不清楚的ORF5[5]。本实验主要通过PCR等方法检测污水厂分离的39株抗性菌株的Ⅰ类整合子以及基因盒的存在情况。通过对含有Ⅰ类整合子-基因盒系统的抗性菌株提取质粒，分析Ⅰ类整合子-基因盒所在的位置。最后，探讨了整合子在介导LFE对抗生素产生多重抗性的作用。 　　2 实验方法 　　2.1 样本采集及DNA的提取 实验菌株来自闵行污水厂中分离的39株耐β-内酰胺类乳糖发酵型肠杆菌。用水煮法（99.5℃，10min）裂解提取菌落DNA。同时做好标记保存使用。 　　2.2 抗性菌株Ⅰ类整合子基因检测 将水煮提取的39个菌落DNA在Ⅰ类整合子基因扩增引物下进行PCR检测，反应总体系为30μL：3μL 10×PCR Buffer，1.8μL MgCl2，3μL dNTPs，正、反向引物各0.6μL，2μL DNA模板，0.2μL的Taq聚合酶，18.8μL超纯水。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变型30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min。最后在1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 　　2.3 抗性菌株Ⅰ类整合子基因盒检测 用上述使用过的39个菌落DNA在Ⅰ类整合子基因盒扩增引物下进行PCR检测，反应总体系为30μL：3μL 10×PCR Buffer，1.8μL MgCl2，6μL dNTPs，正、反向引物各1.2μL，4μL DNA模板，0.4μL的Taq聚合酶，12.4μL超纯水。PCR扩增条件为