基因工程第二章基因工程的酶学基础汇编.ppt

末端转移酶同聚物加尾功能图解 T4多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基转移到DNA或RNA的5’-OH末端，使已脱磷酸化的5’末端重新磷酸化。这种作用不受底物分子链的长短的限制，即使单核苷酸也同样适用。 该酶常用于两种反应：正向反应和交换反应。 （1）正向反应：即催化5‘-OH末端的磷酸化，这是T4多核苷酸激酶的最主要功能。 （2）交换反应 ：当过量ADP存在时，DNA分子的5‘磷酸转移给ADP，然后脱磷酸化的DNA分子再从带有γ-32P的ATP中获得γ-32P基团，重新磷酸化DNA分子就获得了32P同位素标记。 二、T4多核苷酸激酶与DNA 5’端磷酸化 图2-9 T4多核苷酸激酶的正向反应活性（A）和交换反应活性（B） ﹡代表放射性同位素标记 碱性磷酸酶能够催化核酸分子脱掉5‘的磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5’－P末端转换成5‘－OH末端。 碱性磷酸酶有两种来源： 一种来源于大肠杆菌，叫做细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，BAP）； 另一种来源于小牛肠，叫做小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。 三、碱性磷酸酶与DNA 5’端去磷酸化 碱性磷酸酶在基因工程中的用途主要有以下两个方面： （1）DNA分子片段5‘末端的去磷酸化，防止自身连接。 （2）在5‘末端标记之前，去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基团。 图2-10　载体分子的去磷酸化与外源DNA的连接 （引自Weaver，2002） 其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。 第五节 外切核酸酶（自学） 核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 作用于单链的核酸外切酶 　　　如：大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）；大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ） 作用于双链的核酸外切酶 　　　如：大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）；?噬菌体核酸外切酶（ ? exo）；T7噬菌体基因6核酸外切酶 既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶 　　　如：Bal 31核酸酶 第六节　单链核酸内切酶 Bal 31 核酸酶 S1 核酸酶 脱氧核糖核酸酶I 1 2 3 S1核酸酶是一种高度单链特异性的内切核酸酶，催化反应需要Zn2+和酸性条件，最佳pH 4.0～4.5（图2-11）。 图2-11 S1核酸酶的活性 一、S1 核酸酶 S1核酸酶可用于切掉DNA片段的单链突出末端产生平头末端、在双链cDNA合成时切除发夹环结构等。 ExoIII S1 S1 S1 S1 S1 S1 Poly(A) Poly(A) 5 5 5 5 5 5 核酸酶S1活性： Bal 31对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3‘－OH末端迅速降解DNA。 对于线性双链DNA分子，它表现为3‘→5’端的外切酶活性和5‘→3’的外切酶活性，可有控制地从3‘末端和5’末端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子（图2-12）。 Bal 31核酸酶还可起到核糖核酸酶的作用，催化核糖体和tRNA的降解，但它不具有双链特异的核酸外切酶活性。  二、Bal 31 核酸酶 图2-12 Bal 31核酸酶的活性 简称DNA酶I（DNase I），能从嘧啶核苷酸5‘端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5’磷酸末端的寡核苷酸。 三、脱氧核糖核酸酶I 在分子克隆中，DNA酶I主要用于： ①与大肠杆菌DNA聚合酶I联合参与切口平移法标记DNA分子； ②在Mn2+存在下，随机裂解双链基因组DNA分子，构建大片段基因组文库； ③用于DNase I足迹法（DNase I footprint）法分析DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点； 三、脱氧核糖核酸酶I DNase I足迹法分析DNA与蛋白质的互作图解 第七节　RNA酶 包含 RNase T1 RNase A RNase H 核糖核酸酶A可以特异性地攻击单链RNA上嘧啶残基的3‘端，切割胞嘧啶（或尿嘧啶）与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键 反应终产物是嘧啶3’磷酸和末端带嘧啶3‘磷酸的寡核苷酸。 一、核糖核酸酶A 核糖核酸酶H（RNase H）催化DNA : RNA杂合链中的RNA部分的内切降解作用。 它不能降解单链或双链的DNA（或RNA） 在分子克隆中，RNase H主要用于与大肠杆菌DNA聚合酶I和DNA连接酶一起参与cDNA克隆中cDNA的第二条互补链的合成。 二、核糖核酸酶H RNase T1特异性地作用于鸟嘌呤3‘－P，切割在鸟嘌呤的3’－P和相邻核苷酸的5‘－OH之间的磷酸二酯键，其反应的终产物为3’鸟苷酸和末端带3‘鸟苷酸的寡核苷酸