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同时测量阴离子，阳离子：方法验证 摘要：常规方法同时检测阴阳离子采用离子色谱进行分析，但费时费力而且无法测定未知物质。本文利用新型电喷雾式检测器与离子色谱相连同时分析阴阳离子，并对分析方法进行了验证。结果表明，不但灵敏度可低至毫微克水平，而且方法可靠，重现性好，较之单独的离子色谱更是高效、快捷，适于推广。 关键词：ICS-5000，Corona CAD，醋酸铵，阴离子，阳离子 1 前言 同时测定阴离子和阳离子通常用离子色谱法通过一个电导检测器（ICCD）进行分析。这种技术往往需要明确的被分析物，而且阳离子和阴离子，必须分别的使用特定的平台测定。 一个创新的方法是利用电喷雾使检测器（Corona CAD.）与离子色谱ICS-5000相连并选用高分子两性HILIC柱，可将含量低至毫微克级的阴离子、阳离子在一次实验中同时测定且具有重现性。这种方法允许通过梯度优化检测条件，使更多的分析物可在同一套仪器平台上测定，包括：阴离子，阳离子，氨基酸，有机酸，和很多药物活性物质（API）。为广大使用者提供了一种更快，更经济的分析方法，优化简单，包括所有相关元件和流动相组成只需轻微的调整即可。CAD的灵敏度可检测出混合物中含有的0.1％的离子，而大多数的混合物是在药物研发过程中需要根据检测结果进一步调整的，因此快速提供准确结果十分必要。 本应用注解描述了常规的梯度法和验证结果的具体细节。 图1.覆盖8个不同浓度（800ppb—100ppm;.8 - 1000 ng o.c.）的铵离子或醋酸盐中离子。 2 材料与方法 样品制备与分析 下列六个盐都是预先备好的去离子水溶解的浓度为10mg/mL：硝酸铵，氯化铵，硫酸铵，磷酸铵，醋酸钠，醋酸钾。取这些样品的部分混合，然后用80/20乙腈/水稀释到大约以下的盐离子浓度:100，50，25，12.5，6.3，3.2，1.6，0.8μg/mL。额外的样品制备，是用来测试的每一个目标离子的检测方法的准确性。化合物和进样浓度列于表1。 这8点标准曲线和精确称量样品被转移到安捷伦的聚丙烯瓶。标样4（.12.5mg/mL）在检测过程中进样22次，来检查重现性和中间分析准确性。在检测过程中流动相分别准备三次来检查的方法的适用性。 方法参数 仪器：离子色谱ICS-5000 色谱柱：Sequant ZIC. - pHILIC; 4.6 x 150毫米，5μm 柱温：30℃ 进样体积：10μl 流速：0.5 ml/min 流动相A：100 mM的醋酸铵（pH4.6），甲醇，异丙醇，乙腈（15 v:5 v:20 v:60 v） 流动相B：30mM醋酸铵（pH4.6），甲醇，异丙醇，乙腈（50 v:5 v:20 v:25 v） 梯度：表2 Corona：100pA范围，无过滤器 样本瓶：聚丙烯或认证的硼硅酸盐材质 表1.方法的准确性，反离子测定结果的重复性 表2.梯度参数 3结果与讨论 在图1中，在8个不同浓度点重复同一实验。得到的数据符合二阶多项式的拟合并在上 柱8—1000ng符合线性拟合分别如图2A和2B所示。这种分析的准确性通过对有无机盐或包含反离子的有机化合物的比较得以验证。表2列出的是被测化合物和离子重复检测的百分浓度。对所有的离子实验值始终在5％的理论值以内以适合标准化线性如图2A所示。对磷酸盐离子的检测限大于8 ng。因此，磷酸盐只有6个高浓度点（3.2 - 100μg/mL）可以用于浓度曲线。其他离子的所有8个点都可用于制浓度曲线。对6种离子进行线性回归分析，每个单独的标准曲线的相关系数都大于0.9998，符合2阶多项式拟合的系数大于0.993。每一个离子的检测限，低毫微克水平的上柱测试，列于表3中。 重复性和中间分析准确性通过一段时间对标样4（.12.5μg/mL每种盐离子浓度）的峰面积和保留时间的检查得以检测。第一天和第二天标样4均进样5次。再为第4天及第7天的实验准备1瓶新标样，在这两天分别重复进样6次。六个离子的峰面积重现性以及保留时间重现性通过这22数据来检测。第7天的实验也采用了新的流动相，这会引起保留时间数据的小漂移。跨日和日间重复性结果分别列于表3和表4。 结论 本研究收集的数据表明，使用Corona检测器分析离子准确性和重现性良好水平可低至毫微克。所有主要部件通过氯离子，硫酸根，钠，钾进行了测试验证。该分析不是一个包括了所有必要的稳定性级别的完整的验证根据美国FDA Q7A。但它确实证明了检测器和方法的准确性，线性，检测限以及中间精密度。除了方法的灵活性这种验证分析方法的能力使电喷雾成为一种新型的可替代许多传统检测器的实用性技术。Corona CAD是一个强有力的可以替代ICCD的同时分析阳离子和阴离子的检测器。 表3.方法灵敏度（色谱柱上样质量