实验十一DNA凝胶回收汇编.ppt

实验十一 DNA凝胶回收 一、实验原理 通过一定的方法将琼脂糖凝胶上需要的目的DNA带回收下来，用于下游实验。 琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法 1.柱回收试剂盒 2.低熔点琼脂糖 传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法现在用的人已经不多了。 以前经费紧张，低熔点琼脂糖贵，比较经济方法就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再切出来，这样就非常节约了。 仪器及耗材：天平、台式离心机、微量移液器及吸头、EP管。 材 料： 含有目的基因酶切产物的凝胶块 试 剂： AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 ；无水乙醇； 四、实验步骤 1.在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录 1.5 ml 离心管重量） ，该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg 100 μl 体积） 。 2. 加入 3倍凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75°C加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40°C加热） ，间断混合（每 2-3 min） ，直至凝胶块完全熔化（约 6-8 min） 。 * Buffer DE-A为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。 3. 加 0.5倍Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B，混合均匀。当分离的 DNA 片段小于 400bp 时，需再加入 1个凝胶体积的异丙醇。 加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。 4. 吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g离心 1 min。弃滤液。 5. 将制备管置回2 ml离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g 离心30 s，弃滤液。 6. 将制备管置回2 ml离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g离心30 s，弃滤液。以同样的方法再用 700 μl Buffer W2洗涤一次 12,000×g离心1 min。 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。 7. 将制备管置回 2 ml离心管中，12,000×g离心 1 min。 8. 将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管 试剂盒内提供 中，在制备膜中央加 25-30 μl Eluent 或去离子水，室温静置 1 min。12,000×g离心 1 min 洗脱 DNA。 * 将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率 * 是目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。 二、实验目的 1. 从含有目的基因片段凝胶块上回收DNA。 2.回收目的基因片段为下步连接反应作准备 三、实验仪器、材料和试剂 *