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miR―505慢病毒表达载体的构建 　　摘要：目的：构建携带增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）和miR-505基因的慢病毒载体。方法：采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段，通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接，分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy（1.1）GW中，构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞，通过EGFP观察转染效率，RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果：荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光；RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论：成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。 　　关键词：miR-505；慢病毒载体；HEK293T细胞；瞬时转染；RT-PCR 　　中图分类号：R34 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-04-24-3 　　miRNA（MicroRNA）是近年来备受关注的一类内源性非编码小分子RNA，长度为21～25个核苷酸，由具有发夹结构约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，通过与其目标mRNA分子的3端非编码区域（3UTR）互补配对使其目标mRNA分子的翻译受到抑制[1～3]。自从1993年第一个miRNA被报道以来，人们发现miRNAs几乎参与了所有重要的生物学过程的调控[4]，miRNAs的异常表达与人类多种疾病相关[5]。迄今为止，700多种已被鉴定出来的人源性miRNAs调控了人类1/3以上基因的表达。 　　慢病毒为一类逆转录病毒的总称，与其他逆转录病毒载体相比，慢病毒载体主要有以下几个优点：其一，慢病毒载体既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞[6]；其二，由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力，在体外培养细胞实验和体内移植实验中，由慢病毒载体携带导入的目的基因可以在宿主细胞中得到长期而稳定的表达；其三，慢病毒载体可以兼容多个转录启动子，包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的管家基因的启动子；其四，经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因，因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。慢病毒载体的上述优点使其成为体内和体外基因转移的一种有效工具，目前慢病毒也被广泛地应用于表达microRNA的研究中[7]。 　　泛素启动子UBC为人和小鼠细胞的组成型启动子，包含多种转录因子，且具有泛素系统本身的特性，与常用的病毒启动子相比，其细胞来源的特性以及组成型表达的特点可能使它们更加适合驱动外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达[8]。另外，大鼠SynaptinI （突触蛋白I）启动子（FsyI）是在神经元中特异表达的启动子。 　　为提高本研究所用miR-505在中枢神经系统中表达的特异性，选用UBC作为启动子的慢病毒载体FUGW与大鼠SynaptinI 的慢病毒载体L26Fsy（1.1）GW，构建能高效表达miR-505的慢病毒载体，旨在为进一步的研究打好基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505-3p/5p过表达质粒，ASF/SF2过表达载体（上海invitrogen公司）；载体质粒FUGW、L26Fsy（1.1）GW由中科院上海神经所惠赠；PCR引物、测序（上海生工）；EcoRI酶、BamHI等核酸内切酶、klenow大片段、去磷酸化酶、T4 DNA连接酶（大连宝生物工程有限公司）；大肠杆菌感受态细胞DH5α（上海天根化工有限公司）；无内毒素小量质粒抽提试剂盒、中量质粒抽提试剂盒（上海生工）；逆转录试剂盒（MBI Fermentas 公司，美国）；阳离子脂质体lipofectamineTM2000（上海invitrogen公司）；HEK293T细胞（本实验室保存）；DMEM高糖培养基、opti-MEM培养基、FBS（Hyclone，美国），PBS、胰酶（上海宁盛生物科技有限公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 miR-505慢病毒载体的构建及鉴定 　　首先利用以下一对引物： 　　PcDNA-left：5CCGGAATT