酶免疫分析中基于棋盘格的抗原抗体组合变化对检测参数.docVIP

利用棋盘格试验直接筛选酶免疫测定最佳包被抗原抗体浓度的研究 谭伟明1 何素平2 张 蕾1 赵洪伟2 赵 静2 李召虎2 李学锋1 王保民* 2 Qing X. Li3 1（中国农业大学理学院，北京 100094） 2（中国农业大学农学与生物技术学院， 北京 100094） 3（Department of Molecular Biosciences and Bioengineering, University of Hawaii, Honolulu , USA） 摘　要　本文以两个单克隆抗体及其相应的包被抗原为例，研究了包被抗原与抗体组合对免疫检测中0孔吸光度值、IC50值和标准曲线斜率的影响。结果发现，和IC50值随包被抗原与抗体稀释倍数增加而降低；斜率随抗体稀释倍数增加而降低，随包被抗原的稀释倍数表现出先增加后低的趋势对于同一抗体浓度的组合中，斜率最大值出现使板吸附达到饱和的包被抗原浓度。综合确从棋盘格试验中直接筛选最佳包被抗原、抗体组合的标准：选择使板吸附达到饱和的最大包被抗原稀释倍数0孔吸光度值1.0左右的抗体稀释倍数。， 1 引 言 酶联免疫吸附测定（ELISA）是最为常用的免疫化学分析方法之一，现已广泛应用于农药、兽药、环境污染物、真菌毒素、植物激素和中药有效成分等小分子的快速检测。 无论是直接、间接还是简化的间接竞争ELISA[]，各免疫试剂的浓度变化对存在十分重要的影响因此选取最佳浓度的抗体和酶标半抗原或者选取最佳浓度的抗体与包被抗原的组合来建立标准曲线就显得十分重要。 对于ELISA方法建立时各免疫试剂最佳浓度的选择，一般是通过棋盘格试验来进行的。由于棋盘格上所得到的是抑制孔与0孔的吸光度值如何仅根据吸光度值来确定抗体与包被抗原的最佳稀释倍数达到最佳检测性能。已有的文献有下四种选择方法：（1）以一定时间的显色反应后，0孔吸光度值在1.0左右[]，且包被抗原稀释倍数尽可能大，而抗体稀释倍数尽可能小的组合[,10]；（2）以0孔与抑制孔的抑制率[1]并结合0孔的吸光度值来进行选择，即选择那些抑制率大，0孔的吸光度值在1.0左右的组合；（3）以0孔吸光度值在1.0左右[1]的包被抗原与抗体浓度组合为基础，组合标准曲线IC50值；（4）以包被抗原在板上吸附达到饱和的最大稀释倍数作为包被抗原浓度，而抗体稀释倍数则选择在此包被抗原浓度下0孔吸光度值达到1.0的稀释倍数[1, 14]。本实验室在包被抗原与抗体最佳稀释倍数的选择上通常采用的是以0孔与抑制孔吸光度值的差值尽量大，而抑制孔吸光度值尽可能小的经验方法。 本文以两个单克隆抗体及其相应的包被抗原为例，研究间接竞争ELISA棋盘格试验中包被抗原与抗体组合对免疫检测中0孔吸光度值、IC50值和标准曲线斜率影响，同时评价已有的根据棋盘格选择最佳包被抗原与抗体的合理性甘草酸（Glycyrrhizinic Acid，GL）、异戊烯基腺嘌呤核苷（Isopentenyl Adenosine，iPA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（IgG-HRP），邻苯二胺（OPD）均购自美国Sigma公司，其它试剂均为分析纯。GL单克隆抗体GL-OVA联结物由本室制备，浓度2.0 g/L和0.5 g/L； iPA单克隆抗体和iPA-OVA联结物由本室制备，浓度2.0 g/L和0.5 g/L。 96孔酶标板（美国Costar）；Multiskan MK3酶标仪（芬兰Thermo）。 间接竞争ELISA程序 [7]的方法进行。 2.2.2 棋盘格试验 GL：包被抗原浓度梯度为2.0 mg/L ~ 0.06mg/L，抗体浓度梯度为1：2000 ~ 1：64000，抑制孔浓度10 μg/L；iPA：包被抗原浓度梯度为1.0 mg/L ~ 0.008 mg/L，抗体浓度梯度为1：3000 ~ 1：96000，抑制孔浓度为10 μg/L；反应终止后读取抑制孔和0孔吸光度值A10和A0，计算不同包被抗原与抗体浓度组合的0孔与抑制孔吸光度值差值（ΔA）抑制率（I %）试验重复3次。 选取棋盘格试验中0孔吸光度值大于0.7的包被抗原与抗体浓度组合，利用间接竞争ELISA分别建立6个浓度点的标准曲线。非特异性吸附值每个组合标准曲线最高浓度100倍的标样浓度孔。各浓度吸光度值平均值减去非特异性吸附值后除以0孔吸光度值为抑制百分率，抑制百分率与浓度的标准曲线四参数方程拟合，计算50%抑制浓度IC50值和斜率。标准曲线重复4次。3.1 不同稀释度包被抗原与抗体组合对0孔及抑制孔吸光度值影响 由表1和表2可以出，每一包被抗原与抗体的组合中，抑制孔吸光度值始终低于相应0孔吸光度值。同时，0孔和抑制孔的吸光度值都随包被抗原、抗体稀释倍数的增加而降低。 同一组合的0孔与抑制孔吸光度值差值ΔA也随包