生物化学实验 氨基酸的纸最层析法.docVIP

实验 氨基酸的纸层析法 一、目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、?新华滤纸 2、?层析缸 3、?细线 4、?点样管 5、?橡皮筋 6、?电吹风 7、?喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸溶液（甘氨酸，苯丙氨酸），甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、试验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。 4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。 7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看） 六、实验结果 1.标准氨基酸单向上行层析法 定性、定量测定： 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 甘氨酸层析点中心到原点的距离：0.4cm 苯丙氨酸层析点中心到原点的距离：3.2cm 原点到溶剂前沿的距离:10.8cm 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 Rf(甘氨酸)= 0.4cm/10.8cm =0.037 Rf(苯丙氨酸)= 3.2cm/10.8cm =0.296 实验图像： 七、实验分析 由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 注意事项： 1. 在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。防止扩散面积过大，使展层效果不佳或直接影响实验结果。否则分离不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴”的现象, 防止氨基酸斑点重叠。 2. 注意点样线要高于层析液面。防止点样氨基酸溶解于层析液中。滤纸不要贴在层析缸璧上。防止滤纸左右两端展层速度过快，影响实验结果。 3. 均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 4．取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸。并尽可能少接触滤纸。在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点.要将滤纸平放在洁净的滤纸上，不可放在试验台上，以防止污染。 5.展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。 6.在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 7.展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与滤纸平行。 8.风温度不宜过高，否则斑点变黄。 9.影响Rf值的因素有： ①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥