核酸分子杂交的理和实验方法.docVIP

核酸分子杂交的原理和实验方法 原理 所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。 免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。 操作程序 (1) 随机引物标记操作程序如下： ①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。 ②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。 ③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。 ④置37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。 ⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告