03细胞和细胞器及间质的分离探究.doc

第三章 细胞和细胞器及间质的分离 细胞内各种结构的比重、大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，所以常用不同介质、不同转速、不同时间，通过分级离心，将细胞内各种结构组分（细胞核、核仁、线立体、高尔基复合体、溶酶体、染色体等）分离出来。主要方法是：组织匀浆的制备、离心分级分离各组分、分析鉴定三个步骤。 细胞的分离 根据细胞的大小、密度常可分离不同具有不同生物学特征的各种细胞亚群。其原理是处于悬液中的细胞沉降率与细胞的直径成比例，也与细胞密度和分离介质密度之间差异成比例，假设细胞为球形，则其在溶液中在引力场内的沉降速度以下列公式表示V= 2g(ρc–ρs)r2 9η 遵循Stokes定律，其中：ρc和ρs分别是细胞和溶液的密度，η为溶液粘度，r为细胞半径，g为重力加速度。 根据细胞直径（大小）的分离方法：主要是速度下降。细胞在单位引力下，通过低密度介质，或在低离心力作用下，通过密度梯度沉降。由于细胞大小不同，沉降速度不同，细胞越大沉降越快。 根据细胞密度分离是等密度分离，就是细胞在连续密度梯度分离介质中，在强离心作用下，细胞最后到达与其自身密度相同的分离介质层面，并能保持平衡，在非连续密度梯度中，分离的细胞主要集中于介乎其自身密度两种密度介质的交界面上，从而达到分离。 操作方法： （一）单位重力沉降法： 分离介质主要是牛血清白蛋白，其分离的细胞活性高、费用也昂贵。现已用蔗糖替代， 仍能取得较好的分离效果。 1．在固定沉降池上方加入30ml PBS/BSA，含有细胞1×108于池底。 2．从池周边加入50ml PBS覆盖于样品上，不要使整个界面破坏。 3．下口接1％蔗糖梯度液，稍松下口，缓慢放入50ml 1%蔗糖梯度液，约10ml/min。 4．接通梯度混合仪，从下口加入1200ml 1~2%蔗糖梯度液，速度为50ml/min。 5．最后加入500ml 2.5%蔗糖梯度液。 6．整个沉降系统，于4℃，静置4h，这时细胞按大小先后沉降，未成熟的红细胞在 先，成熟的网织红细胞在最后。 7．用自动收集器每15ml收一组分，流速15ml/min。 8．收集的细胞经过PBS清洗，300g×10min离心2次，以去除蔗糖。 9．Giemsa染色，确定各期细胞所在组分。 （二）等密度梯度离心法： 1．Ficoll-Hypaque分离细胞： 直接用Ficoll作分离介质，粘度大，效果不明显，加入Hypaque可降低分离粘度，提高分离效果。 （1）制备分离液Ⅰ（比重1.077g/ml）：取10份；33.9% Hypaque，24份；9% Ficoll混匀。 （2）制备分离液Ⅱ（比重1.119g/ml）：取10份；50% Hypaque，20份；9%Ficoll混匀。 （3）制梯度 用硅化的15ml玻璃管，底部加入4ml分离液Ⅱ，然后用注射器在其上小心加入4ml分离液Ⅰ。不要破坏梯度界面。 （4）加入2ml血清样品于梯度顶部，不要破坏梯度界面。 （5）800g×20min，25℃，平甩离心。 （6）离心后可见：最上层是血浆和血小板；血浆与分离液Ⅰ界面是淋巴细胞（90％）和单核细胞；Ⅰ液与Ⅱ液界面是多形核细胞；沉底的是红细胞。 2．Percoll分离细胞： Percoll是一种外面包裹着PVP的硅胶颗粒，对细胞无吸附作用，产生的渗透压非常小，因此在全部密度范围保持等张。可在较短的离心速度下，短时间达到浮力密度平衡，对细胞无毒性、无副作用，易于从细胞表面洗脱。 （1）分离骨髓细胞： ① 配制100% Percoll ：取20mlPercoll原液，加1.5ml×10 PBS、0.2ml Ca/Mg液。 用0.01mol/L HCL调pH至7.2，用NaCl或水调渗透压至295～310mosmol/L。 ② 用PBS配制：40% Percoll、70% Percoll、80％ percoll。 ③ 按比重大小，每一浓度取10ml通过注射器加入50ml离心管三层，两个界面。 ④ 将1×108细胞的2ml骨髓细胞悬浮液小心加于梯度顶部。 ⑤ 3,000g×30min，18～20℃，平甩离心。 ⑥ 用平滑头吸管，小心均匀的吸出所需细胞，在40%与70%介质界面，主要是幼稚细 胞。 ⑦ 用20倍体积PBS洗涤细胞，300g×15min离心，收集细胞。 （2）分离血细胞： ① 5ml 60% Percoll，5ml全血，250g×10min，室温平甩离心，上层为血浆和血小板，Percoll顶部为淋巴细胞，底部为白细胞和红细胞。 ② 4ml 80%Percoll，4ml 60%Percoll，4ml全血，350g×20min，室温平甩离心，80%～60% P