2015-5-20复习重组DNA技术资料.ppt

载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接 重组体 转化 体外包装，转染 重组体进入宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 重组DNA技术操作的主要步骤 六、 外源基因的表达、分离与纯化 外源基因的蛋白表达 原核表达体系 分离、纯化与鉴定 真核表达体系 五、克隆基因的表达 外源基因的表达 表达产物蛋白质的分离、纯化与鉴定 供体细胞 载体分子 外源DNA 外源基因 分离 酶切 酶切 连接 转化 扩增 DNA重组分子 受体细胞 鉴定与表达 重组转化子 工程菌 或细胞蛋白产物 工程菌或细胞培养 重组产物分离纯化 基因工程基本流程示意图 DNA重组技术的应用 1.基因工程药物 2.基因诊断 3. 基因治疗等 思考题 DNA重组技术、克隆、限制性内切酶、载体、转化、转染 质粒作为载体符合哪些条件？ 简述基因工程的基本操作步骤及应用。 基因工程 Gene Engineering （重组DNA技术） 重组DNA技术（基因工程技术） 在体外对不同来源的DNA分子经重新组合形成重组体，并导入宿主细胞建立无性繁殖体系的过程。 又称：DNA克隆，分子克隆，或基因工程。 基本概念 DNA重组： 不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程。 克隆： 指由一个细胞经过无性繁殖形成子代群体的过程。 第一节 工具酶 限制性内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 工具酶 逆转录酶 碱性磷酸酶等 第一节 工具酶 限制性内切酶概念： 一类能够有选择的识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在识别位点及其周围切割双链DNA中磷酸二酯键的核酸内切酶。 简称限制酶，大多从细菌中发现。 第一节 工具酶 （一）分类 限制性内切酶分为三种类型 I、 Ⅲ型 ：不常用 Ⅱ型：具有高度特异性的DNA裂解点， 是基因工程中最重要的工具酶。 C T T A A G G C A A T T 例：EcoRI 酶切位点 限制性内切酶（ restriction endonuleases ）：从特殊的酶切位点将DNA分子切开 5，G AATTC 3， 3，CTTAA G 5， 切口类型： 例：Hpa I 5，GTT AAC 3， 3，CAA TTG 5， 平末端: 粘末端 3，突出末端: 5，突出末端: 例：EcoR I 5，G AATTC 3， 3，CTTAA G 5， 例：Pst I 5，CTGCA G 3， 3，G ACGTC 5， 粘性末端：错开突出的单链末端，很容易与互补的单链末端 配对粘合起来，因此称为粘性末端 。 限制性内切酶 第一节 工具酶 DNA连接酶 连接酶（ ligase ）：能够催化双链DNA分子中相邻的3’-OH和5’-P末端之间形成磷酸二酯键,使DNA分子连接起来的酶. 例如： T4-DNA连接酶 第一节 工具酶 逆转录酶（reverse transcriptase） 末端转移酶 TaqDNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ 其他工具酶 用于通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外合成扩增 第二节 重组DNA常用载体 载体 是携带目的DNA片断进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，本质是一段核苷酸序列。 载体的条件 1. 自我复制能力 2. 具有多个酶切位点，供外源基因插入 3. 具有合适的筛选标志 4. 分子量不宜过大 第二节 DNA重组载体 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒载体等。 按用途有克隆载体、表达载体 一、质粒载体 细菌染色体外具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 质粒载体条件 1.具有松弛型复制子 2.存在数个限制性酶切位点， 便于目的DNA插入 3.具有筛选标志 4.分子量相对较小 复制起始点 AMP抗性 pBR322 4363bp Tet抗性 第三节 重组DNA的基本步骤 重组DNA的基本过程 一、目的基因的制备 二、载体的选择与构建 三、目的基因与载体的连接 四、重组DNA导入宿主细胞 五、重组DNA的筛选与鉴定 六、外源基因的表达、分离与纯化 第三节 DNA重组与鉴定 一、目的DNA片断的制备 来源： 1 ．基因组DNA genomic DNA 2． cDNA complementary DNA 制备cDNA 3．人工合成DNA片段 人干扰素、胰岛素、脑啡肽、血管紧张素、胸腺素α等 4．PCR或逆转录酶PCR扩增特定的 DNA片段或cDNA 二、载体的选择与构建 根据实验目的，选择合适的载体 质粒 噬菌体 三、目的DNA片断与载体的连接 粘性末端连接法 平末端连接法 同聚体加尾连接法 人工合成接头连