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第7章 蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化 透析和超过滤 超速离心 层析（色谱） (chromatography) 电泳 (electrophoresis) 1 透析和超过滤 2 超速离心 3 层析（色谱）（Chromatography） 两相：固定相（静相）和流动相（动相） 有效分配系数： 层析 按流动相：气相、液相色谱等； 按操作形式不同：纸层析、薄层层析、柱层析等； 按分离机制：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等。 3.1 纸层析（Filter-paper chromatography） 3.2 薄层层析（Thin-layer chromatography） 根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。 介质：凝胶颗粒（多孔的网状结构） 交联度或孔度（网孔大小）——凝胶的分级分离范围 交联葡聚糖——Sephadex G-50（1500-30000） 琼脂糖 ——Sepharose或Bio-Gel A 聚丙烯酰胺——Bio-Gel P ② 离子交换层析（Ion-exchange chromatography） 根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。 介质：离子交换树脂 溶液中的离子与树脂上的带电基团进行交换反应； 各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同； 在洗脱过程中，各种离子迁移率不同，达到分离的目的。 氨基酸的定性定量 茚三酮反应： 生成紫色物质 脯氨酸和羟脯氨酸生成黄色物质 ③ 亲和层析(Affinity chromatography ) 根据蛋白质与特异的配体相互作用来分离的。 4 电泳 (Electrophoresis) 在外电场存在下，利用蛋白质分子携带的净电荷不同以分离混合物 Arne Tiselius获1948年诺贝尔化学奖 4.1 凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶（蛋白质和多核苷酸） 琼脂糖凝胶（核酸） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 不连续：浓缩胶和分离胶 电泳迁移率决定于所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。 巯基乙醇：打开二硫键。 SDS：变性剂，破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。 SDS以其氢键与蛋白质分子的侧链结合成复合体。 ① 带有很多负电荷——远远超过蛋白质分子原有电荷 ② 改变了蛋白质单体分子的构象：近似雪茄烟形的长椭圆棒， 短轴长度相同，长轴长度随蛋白质的相对分子质量成正比例变化。 4.2 等电聚焦电泳 高分辨率的蛋白质分离技术。 在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场的作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。 特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02pH单位的差别就能分开。 等电聚焦电泳 4.3 双向电泳 等电聚焦电泳 + SDS- PAGE 第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点； 再沿垂直的方向进行分子量的分离. 作业题 P317 ：5，7 + 凝胶 加样 P309 迁移率主要取决于蛋白质相对分子量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS- PAGE） 迁移率 P310 电泳时，每种蛋白迁移至 与它的pI相一致的pH处 加入 蛋白样品 电场作用下在凝胶中建 立稳定的一个pH梯度 pI降低 分子量 减小 * * P302 P302 基本原理： 层析由流动相和固定相组成 样品作为流动相流过固定相 各组分在两相中分布程度不同 各成分迁移率不同 分离 P148 相对迁移率 P151 P152 3.3 柱层析 ① 凝胶过滤层析 (分子排阻层析 、分子筛层析 ） （Gel-filtration chromatography） P303 原理： P152和310 蛋白质 ＋ 配体 蛋白质配体复合物 P313 ④ 高效液相层析 （High-Performance liquid chromatography , HPLC） P154和314 也分为凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等 特点：固定相支持剂颗粒细 采取高压，洗脱速度增大 P307 电泳仪 水平电泳槽 垂直电泳槽 * *