2014年分子生物学预习作业答案.doc

分子生物学预习作业 学号 班级 姓名 一、本学期分子实验的主要内容是： 质粒的碱裂解法提取 PCR扩增质粒中的基因片段 琼脂糖电泳 胶回收DNA片段 酶连 感受态的制作以及转化 二、实验流程及时间安排： （一）实验流程（一般2人一组）： 实验准备——质粒提取——PCR扩增目的片段——琼脂糖电泳鉴定——割取目的片段——胶回收琼脂糖中的目的片段——酶切——琼脂糖电泳——割胶回收酶切过的片段——连接反应——感受态的制作——转化——观察实验结果。 （二）时间安排： 第一天（全天，周五）：质粒的提取；PCR扩增目的片段；琼脂糖电泳并割胶 第二天（全天，周六）：胶回收目的片段；酶切；割胶回收；连接反应（过夜） 第三天（全天，周日）：感受态细胞的制作以及重组质粒转化入DH5α 第四天：看转化结果，整理实验室。 有双学位的同学必须参加第一天（周五）实验，之后的实验请跟老师预约。 三、主要实验操作： 质粒的碱裂解法提取： 1、将含有pEGFP-N1以及UXT基因的两种质粒的大肠杆菌DH5α10μl分别接种到10ml含卡纳霉素(终浓度100μg /ml)的LB培养液中，37℃振摇过夜。 2、取1.5ml菌液转入Eppendorf管中，12000rpm离心1分钟，除去上清（可以再加1.5ml菌液离心，以提高细菌细胞的数量）。尽可能吸干培养基。 3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ（可以加入RNase，终浓度1mg/ml）中，旋涡振荡混匀。 4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻缓颠倒Eppendorf管5次，以混合内容物，禁止剧烈振荡。此步注意动作要轻柔，时间不超过5分钟。 5、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中3-5分钟。 6、用台式高速离心机12000rpm 离心5分钟，将上清转入另一Eppendorf管中。如上清液浑浊则需重新离心一次。 7、加入与上清等体积酚/氯仿/异戊醇，旋涡振荡混匀后，12000rpm离心5分钟，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。 8、向上清液加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀（可以震荡），室温放置３min。用离心机于12000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。 9、用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，上下颠倒混匀，12000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上，约10-15分钟)，备用。 10、用1%琼脂糖电泳估算质粒的浓度以及大小。 11、用核酸测定仪分析DNA的质与量。 溶液Ⅰ（pH8.0）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后加入RNase（1mg/ml）。 溶液Ⅱ：0.2mmol/L NaOH， 1% SDS（m/V）。室温使用，现配现用。 溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾 60ml，冰乙酸11.5 ml，水28.5ml。所配成的浓度中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。保存于4度，用时置于冰浴中。 PCR 1、了解PCR各组成成分的原始浓度，并根据PCR的总体积，计算各组成成分的用量，并记入下表； 2、设计PCR的阴性对照组与阳性对照组，并计算各组相关成分的用量，并写在实验报告中； 3、取冰块，在冰上按照计算好的用量进行PCR各个成分的加样（注意加样顺序！注意不要将样品加到管壁上！）； 4、上机，记下PCR程序的各个参数； 5、琼脂糖电泳检测PCR结果。 PCR成分 原始浓度 终浓度 使用量 各成分多少对PCR的可能影响 模板 300ng/ml　 　 　 引物F 10uM　 　 　 引物R 10uM　 　 　 dNTP 2.5mM/each　 　 　 Taq酶 5U/ul　 　 　 10×Buffer（含Mg2+） 10×　 　 　 ddH2O 　 　 　 总体积 　 　 50ul　 琼脂糖电泳 1、制胶（1%琼脂糖） 称取DNA电泳用琼脂糖放入100ml三角烧瓶中，加1×TAE缓冲液，将烧瓶置微波炉或电炉上加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。待凝胶溶液冷却至60℃左右时，混匀后趁热将凝胶溶液倒入插好适当梳齿的电泳板上。室温下待凝胶完全凝固(约需30分钟)，拔出梳齿，将凝胶连同制胶板一起放入电泳槽中。注意，上样孔在电泳槽负极一端。 2、电泳 向电泳槽中加1xTAE缓冲液