5-1电泳技术方案.pptVIP

电泳原理示意图 按作用类型分类： SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 尿素－ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳? 梯度-SDS肽图谱 、蛋白质转印 免疫电泳 毛细管电泳 琼脂糖（核酸）电泳 (二）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳： 电泳是指带电粒子在直流电场中移动的现象。聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳: 在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 －－浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。 －－分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8Tris-HC1。 －－电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 （1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 很重要的因素：(pH 6.9, 是 glycine 的 pI)。 在样品通过浓缩胶体時，可产生聚集作用，使原來体 积很大的样品溶液，聚集成一薄层(disc)，可增加解析度。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； （c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。 不连续系统浓缩效应示意图  3. 电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置 4. 支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大  二. 影响因素 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有： 为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3； 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～100mmol/L； 二硫键是否完全被还原。 三. 实验试剂和配方 2.实验试剂 （7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液  250ml， 过滤后备用。（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。 3. 实验器材 电泳装置（垂直板） 直流稳压电源 移液管 滤纸 微量注射器 大培养皿 三. SDS操作 三. SDS操作 (一）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 当蛋白质的分子量在15，000－200，000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系， 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，