5-分子标记及相关的实验技术技术方案.ppt

第三节：分子标记 1、几种主要分子标记简介 2、植物核酸的提取 3、PCR技术 4、Southern杂交技术 1、几种主要分子标记简介 1）RFLP标记 RFLP标记基于Southern杂交技术。 限制性片段长度多态性。 这种多态性是由于限制性内切酶酶切位 点或位点间DNA区段发生突变引起的。 2）RAPD 标记 随机引物PCR标记。 模板DNA扩增区段上引物结合位点碱基发生突变或扩增片段之间发生插入突变或缺失突变，因此表现为扩增产物的有无或片段的大小的差异。 RAPD通常是显性的——片段的有无。 有时为共显性——片段的大小的差异。 RAPD所用引物通常为9—10个碱基，因此，PCR要用较低的退火温度（36℃ ）。 3)SSR标记 SSR是特异引物的PCR标记。称为微卫星或简单重复序列。 重复单元为几个核苷酸，重复次数一般为10-50个。 由于基本单元的重复次数不同而形成SSR座位的多态性。 根据SSR座位两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列。 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的迁移距离，就可 知某个SSR座位上的多态性。 优点：多态性十分丰富，共显性。 缺点：引物设计比较困难。 4）AFLP标记 AFLP是基于限制性酶切和PCR的DNA标记。 将样品DNA用限制内切酶进行酶切，再对酶切片段进行有选择地扩增，检测其多态性。 5) CAPS标记 特异引物PCR与酶切相结合的一种标记。 根据RAPD标记或RFLP标记，设计特异引物进行PCR扩增（SCAR，STS）。有时扩增片段大小无差异，此时对扩增片段进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。 揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息。 6）SNP标记 基于单核苷酸多态性的DNA标记 鉴定SNP最直接的方法是通过设计特异PCR引物扩增某个特定区域的DNA片段，通过测序和遗传特征的比较来鉴定该DNA片段是否可以作为SNP标记。 SNP在基因组中广泛存在，数量丰富。 2、植物核酸的提取 基本步骤： 磨样——缓冲液浸提——抽提——沉淀核酸——70%酒精洗——溶解核酸 1）DNA提取 CTAB法 根据试剂不同分为 SDS法 大量制备 根据实验目的不同分为 小量制备 1.1 CTAB法 CTAB是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液中(＞0.7 mol/L NaCl)可溶，并且稳定存在。 在低盐条件下(＜0.5 mol/L NaCl)， CTAB与核酸的复合物就会沉淀，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。 当材料中多糖少时，可不用 1% CTAB 沉淀缓冲液来沉淀 DNA，在经氯仿-异戊醇(24∶1)抽 提之后，用异丙醇或乙醇沉淀 DNA，使提取过程简化 用异丙醇或乙醇沉淀核酸，CTAB则溶于乙醇中。 CTAB法获得的核酸质量好，完整20-40kb，RNA少。 例1、CTAB法小量制备植物DNA 以小麦为例： CTAB缓冲液： 1.4M 山梨醇 10ml 1M Tris_Cl PH8.0 22ml 0.5M EDTA PH8.0 4.4ml CTAB 0.8ml N-LSC 1g 加水至100ml (1)取少许小麦叶片,放入1.5ml离心管中,加入液氮冷冻,用带尖的玻璃棒研碎。 (2)加入500ul,65℃预热的缓冲液混匀,65 ℃