利用RAPD技术研究柳属种间亲缘关系重点.ppt

利用RAPD技术研究柳属种间亲缘关系 * * L/O/G/O 垂柳 龙爪柳 1 2 3 4 5 研究背景 仪器、材料 研究方法 结果分析 可行性分析及展望 本世纪 60年代以来，分子标记（ molecular marker）技术作为一种新型的遗传标记形式在生物的遗传育种和遗传研究等方面发挥了越来越大的作用，在众多的 分子标记中，由 Williims和 Welsh等建立起来的 RAPD技术以快速、准确、灵敏等特点，受到了生物学领域研究者的重视和广泛应用。 １ 研究背景 RAPD(random amplified polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA标记。其以基因组DNA为模板, 以单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物, 在热稳定的DNA聚合酶作用下, 进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上 。 ＲＡＰＤ技术简介 作为PCR技术的延伸，RAPD区别于PCR表现在： １．RAPD使用随机引物，引物具通用性； ２．引物在每个反应中加一种而不是一对； ３．退火温度较低，一般为36℃； ４．此外，较常规PCR更适宜程序化。 柳属Salix L .全世界约520种,我国有275种．柳属是分类极为困难的植物类群之一,其原因是:柳属为柔荑花序,花部形态简单,能提供的用于分类的特征少;柳属的种间或居群间特征变异大,而普遍的自然杂交现象使得种间的形态界限更加模糊;柳属为雌雄异株,而且雌、雄花开放、叶长出的时间往往不一致,因而很难在同一个植株或个体上看到一个种的所有特征。因此,仅有外部形态性状常难以很好地解决其分类学问题 仪 试 器 剂 模板DNA（10～100ng） 寡核苷酸引物（20mmol/L贮存液） 0.2 mmol/L dNTPs Taq DNA聚合酶 10×PCR缓冲液 电泳所需试剂等 PCR扩增仪 电泳装置 微量离心机 微量移液器 0.5 ml Eppendorf管 紫外线观察装置及照相设备 ２ 仪器材料 ３ RAPD标记的操作步骤 选择材料 龙爪柳 （Salix matsudana Koidz. Var.tortuosa） 5 镘头柳 （Salix matsudana Koidz. Var.umbraculifera Rehd） 4 白柳（S.alba） 3 垂柳（S.babylonica） 2 旱柳（S.matsudana） 1 种质名称 Name 编号 Material no. ＲＡＰＤ技术的基本步骤 模板DNA的制备与调整 　采用CTAB法提取DNA的方法提取基因组总DNA（gDNA）DNA沉淀经溶解稀释后琼脂糖凝胶电泳检测OD值，确定提取的质量和浓度，最后将合格的ＤＮＡ提取液浓度调整一致，－２０℃保存备用。 CTAB法提取DNA 加入样品，离心，取除去上清 加入PBS震荡离心 加入CTAB buffer震荡 培养20分钟然后离心 取上清液加入RNA酶培养 加入等体积苯酚 离心，取上清 加入异丙醇 放置使DNA沉淀 倒出上清，风干DNA 加入TE buffer溶液在 在70度条件下5分钟 用Nanodrop检测DNA ＰＣＲ各组分的混配 DNA扩增 将盛放以上各组分的离心管放在PCR仪上，按反应程序设定进行DNA扩增，设置:94 ℃预变性2min, 94 ℃ 变性1 min, 36 ℃退火1min,72 ℃延伸1. 5 min, 72 ℃终延伸5 min, 40 次循环;4 ℃保存。 PCR 扩增产物的检测　　　　　　　　以大、小Marker( DNA/H ind III和D2000) 为标准分子量, 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳,其中含有浓度为0.5ｕg/ml 溴化乙锭, 取 2ｕl 的 loading buffer 与扩增产物混匀, 10ｕl 点样, 电压为100V, 电泳2h,最后用成像系统照相保存 引物的筛选 用上述方法对约120个随机引物进行筛选, 最后挑选出稳定、分辨率较好的若干个引物。 数据的记录 RAPD扩增重复2次独立的试验得到稳定的电泳 图谱．RAPD扩增产物以1、0统计建立二维矩 阵在相 同迁 移位置上(相 同分子 量片段 )有带记为“1”，无带记为“0”．根 据 Nei＆ Li(Czekanowski(1913))公式计算遗传相异系数 Sxy相似性系数 Sxy＝2Nxy／(Nｘ+Nｙ)，Nｘ代表在材料 X中某一引物扩增的条带数 ，Nｙ代表在材料 Y中同一引物扩增出的条数 ，Nxy代表在 X和Y中扩增出