嗜酸氧化硫硫杆的分离鉴定.docVIP

嗜酸氧化硫硫杆菌的分离鉴定 嗜酸氧化硫硫杆菌[78]（Acidithiobacillus thiooxidans At.t）是一类硫氧化细菌的总称，它们在形态学和生理学上存在着多样性，而且可能是不同种类的细菌[79]。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans, At.f）和嗜酸氧化硫硫杆菌是目前在生物冶金方面研究最多、最重要的两种菌。氧化亚铁硫杆菌利用铁源浸矿时会在矿物表面形成硫层，阻碍进一步浸矿，而嗜酸氧化硫硫杆菌却可以利用硫，将阻碍浸矿的硫层除去[80]，因而它在浸矿中的作用尤为重要。 本文从土壤样品中分离纯化出了一株硫氧化细菌，对其进行了形态学、生理生化特征和16S rDNA鉴定和分析，为后面探讨其浸矿机理奠定基础。鉴定结果表明此菌属于嗜酸氧化硫硫杆菌，命名为HY-01。 2.1 试剂与材料 2.1.1 菌种来源 实验所用菌株为本实验室从湖北大冶铜山口酸性土壤中分离所得；大肠杆菌为本实验室保存菌种。 2.1.2 主要试剂 升华硫，化学纯，天津市福晨化学试剂厂；琼脂粉，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨，生化试剂，日本进口；酵母抽提物，生化试剂，日本进口；二苯胺磺酸钠，化学纯，国营昆山化工试剂厂；乙二胺四乙酸钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯。 2.1.3 培养基 实验室使用的各种培养基配方如下： Waksman 培养基[81]： NH4 2SO4 0.2 g，K2HPO4·3H2O 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.126 g，S0 10.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 2.0。 Starky-Na2S2O3-琼脂培养基[81]： NH4 2SO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.25 g，KH2PO4 3.0 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，Na2S2O3 10 g，琼脂 3.0 g，蒸馏水 1000 mL。 基础培养基： NH4 2SO4 0.2 g，K2HPO4·3H2O 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.126 g，蒸馏水1000 mL，pH 2.0。 LB培养基：1 g蛋白胨，0.5 g酵母提取物，1 g NaCl，溶于100 mL蒸馏水中，pH 7.0。 2.1.4 缓冲液 STE缓冲液：Tris-HCl（pH7.6）0.2 mol/L，NaCl 0.5 mol/L，SDS 0.1%，EDTA 0.01 mol/L； TE缓冲液：Tris-HCl 10 mmol/L（pH7.6），EDTA 0.001 mol/L； 50×TAE缓冲液：242 g Tris碱，57.1 mL冰醋酸，100 mL 0.5 mol/mL EDTA pH 8.0 ，加双蒸水至1L。电泳缓冲液常用0.5×TAE缓冲液； 10%SDS溶液：10%（w/w）的十二烷基磺酸钠溶解于蒸馏水中，可加热到68℃溶解。 醋酸铵缓冲液：取醋酸铵100 g，加水300 mL使溶解，加冰醋酸7 mL，摇均即得。 2.1.5 酶及试剂盒 [1] 酶：Taq DNA 聚合酶购自武汉鼎国生物技术有限公司，T4DNA连接酶购自Takara公司，溶菌酶，蛋白酶K，Rnase，均为上海生工产品。 [2] 试剂盒：PCR产物纯化试剂盒，GenExtractTM质粒小量快速提取试剂盒，PMD-18 Vector连接试剂盒，均为Takara公司产品；DNA Marker DL2,000 ，Loading buffer购自武汉鼎国生物技术有限公司。 2.1.6 引物合成与测序 扩增16S rDNA的PCR扩增引物为： Pf：5-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 Pr：5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3 引物由武汉鼎国生物技术有限公司合成，测序由六合华大基因科技股份有限公司完成。 2.1.7 主要仪器设备 表2.1 主要仪器与设备 Table2.1 The main equipments 型号 名称 生产厂家 3K30型 台式冷冻离心机 SIGMA SPX-250B-Z型 生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 HZ200LB型 恒温培养摇床 武汉瑞华仪器设备责任有限公司 UV-2000型 紫外-可见分光光度计 龙尼柯（上海）仪器有限公司 DELTA 320 pH计 Mettle-Toledo Group（上海）有限公司 YX280A 手提式不锈钢蒸汽消毒器 上海三申医疗器械有限公司 85-2型 磁力恒温搅拌器 上海司乐仪器厂 FM70型 制冰机 格兰特公司 PCR仪 德国eppen