定量PCR方法数据分析.pptVIP

定量PCR原理、应用及数据分析 ZJW 原理： PCR（多聚酶链式反应)：一种体外扩增特异DNA片段的技术。反应分为变性（denaturation）、退火（annealing）、延伸（extension）三步。 PCR扩增理论方程： 起点定量与终点定量： 起点的DNA量为“天然”的含量，更有意义；终点的DNA量为经过PCR过程 “加工”的量，存在部分“失真”。（终点定量存在更大的误差） 定量PCR：通过实时监测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量或者定性的分析 化学原理：荧光染料嵌合法, 探针法 SYBR Green I（不饱和型），Eva Green / LC Green（饱和型），与dsDNA小沟部位嵌合，具有绿色激发波长。游离时不发光。 缺点：需用melting curve检测产物特异性。 探针法：可用于多重PCR及基因分型 TaqMan 探针：检测积累荧光 一种寡核苷酸探针, 探针两端各锚定一个基团，淬灭剂则在3‘末端。 Taqman探针识别并结合特定的靶序列； 探针完整时，报告基团R发出的荧光被淬灭基团Q吸收； 在进行延伸反应时,Taq聚合酶的 5’外切酶活性将探针切断, 使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。 基线：扩增曲线中的水平部分 阈值（Thre