“冷俊”槭查尔酮异构酶基因CHI片段克隆及序列分析.docVIP

“冷俊”槭查尔酮异构酶基因CHI片段克隆及序列分析 摘要：以槭树品种“冷俊”为试材，利用RT-PCR技术，根据GenBank中登录的相关物种查尔酮异构酶基因（CHI）的保守序列设计简并引物，提取其秋季变色期叶片中的总RNA并扩增出CHI基因的cDNA片段。测序结果表明，该片段长553 bp，编码183个氨基酸。序列分析表明，该片段与龙眼、橄榄、山茶、沙梨等的同源性在81%～90%以上，证明已成功克隆到槭树变色期叶片CHI基因的cDNA片段，在GenBank中登录号为KC121346。 关键词：槭树；CHI基因；克隆；序列分析 中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0012-04 1材料与方法 11材料 试验于2011年11月在山东省果树研究所观赏园艺室进行，以槭树品种“冷俊”的秋季变色叶片为试材。于11月份采集叶片，迅速放入液氮中冷冻，带回实验室放入-80℃冰箱中备用。 12试剂 PCR kit、cDNA kit购自大连宝生物工程公司，PCR引物合成及测序工作则由上海生工生物工程技术服务有限公司进行。 13方法 131叶片总RNA提取参考招雪晴等[10]的方法，采用改良CTAB法提取槭树叶片总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度计测量OD值。 反应条件：98℃变性30 s，然后按98℃ 10 s、57℃ 25 s、72℃ 30 s进行35轮循环反应，最后72℃延伸6 min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。PCR产物送上海生工测序。 134序列分析通过BLASTN 进行同源性比对分析。用DNAMAN 60软件分析DNA 序列并进行多序列比对，翻译出氨基酸序列后在BLASTP中搜索相似性高的蛋白质序列。 2结果与分析 21槭树叶片总RNA的制备 利用改良的CTAB法提取槭树叶片的RNA，测量其OD值，结果为201，表明蛋白污染少。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，28S、18S条带较清晰，无降解，说明所提取的RNA纯度和完整性较好，无DNA污染，符合cDNA合成的要求。 22槭树叶片CHI基因片段的克隆与测序 利用设计好的简并引物，以槭树叶片cDNA为模板进行PCR扩增，得到了与预计片段大小一致的片段（图1），测序后的cDNA片段为553 bp，编码183个氨基酸（图2）。 3结论与讨论 Druka 等[11]曾报道CHI cDNA序列的同源性一般为 42%～65%， 不同物种或同一物种不同类型的CHI也有较大的差异，给同源克隆CHI带来一定的困难。本试验表明，用于扩增的引物设计是同源克隆成功的重要因素，不合适的引物无扩增条带或产生弥散，而保守性好、GC含量高的引物克隆结果较好。故选择保守区间GC含量高的区域有利于同源克隆试验的成功。 目前研究结果表明，CHI是影响植物颜色形成的重要酶之一，会直接影响植物颜色表达。目前对CHI基因的研究主要在序列分析、基因克隆及转基因表达调控等方面。对CHIA和CHIB启动子DNA序列研究表明，启动子中有高度保守的序列37 bp[12]。菜豆和矮牵牛的氨基酸组成与从豌豆胚轴上克隆的CHI基因氨基酸序列显示较高的同源性[13]。现已在多种植物中克隆到CHI基因，并开始在转基因植物中应用。Muir等[1]曾将矮牵牛CHI基因转入番茄并获得了转基因番茄，结果显示番茄果皮中黄酮类含量增加了78倍，果肉中黄烷醇增加了21倍。将CHS和CHI基因导入矮牵牛，转基因植株花的颜色发生了改变，花器官也发生了变异[14]。洋葱中CHI基因突变引起CHI酶活性的丧失，导致洋葱变为金色[15]。对CHI基因的研究，前人大部分以蔬菜、水果、花卉等物种为试材，但对木本园林植物CHI基因的研究较少，本试验利用同源克隆的方法，首次以槭树为试材克隆出CHI基因cDNA片段，为下一步克隆槭树CHI基因cDNA全长奠定基础，该基因在槭树秋季变色过程中起何种调节作用，还有待于进一步研究。 参考文献： [1] Muir S R， Collins G J， Robinson S， et al Overexpression of petunia chalcone is omerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols[J] Nature Biotechnology， 2001， 19： 470-474 [2]周发俊，王逸群，陈由强植物查尔酮异构酶分子生物学研究进展（综述）[J] 河北科技师范学院学报，2008，22（1）：73-75 [3]Vantunen A J， Koes R E， Spelt C E， et al Cloning of the t