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HCV 复制子的研究与应用 第三军医大学西南医院感染病分院 全军感染病研究所 王 小 红 HCV研究存在的问题 HCV疫苗研究尚未获得突破进展 急需新型的抗HCV药物 研究主要障碍： 缺乏合适的细胞模型及小动物模型 HCV 细胞模型的发展 HCV基因组的异质性 基因型(Genotype)：1型,2型,3型,4型,5型,6型 亚型(Subtype)：1a,1b,2a,2b,2c,3a等 50多型 准种(Quasispecies)：同一个体内存在着一群密切相关但不相同的变异株。 HCV复制子研究中的重要问题 复制子的构成 细胞的容受性 适应性变异 异源性序列的作用 完整病毒颗粒的装配 细胞的容受性 Huh-7细胞 不同传代的Huh-7细胞容受性有100多倍的差异 Huh-7.5细胞 “Curing”细胞 适应性变异的常见位点 集中于NS5A富含丝氨酸的中心区域 NS3解链酶的分子表面 NS4B的两个位点 K1846T和V1897L/M/A HCV复制子研究现状 H77序列复制子能在Huh-7.5细胞系中复制而不能在Huh-7亲代细胞中复制，强调细胞因素对HCV复制的重要性 H77序列复制子至少需要两个适应性变异， S2204I，A1226D或 P1496L。Con1复制子共发现4个适应性变异：R1283G，E1383A，K1609E，K1577R。另有E1202G，T1280I。目前，这8个适应性变异中有7个位于NS3螺旋酶区域。适应性变异加强HCV体外复制的机制尚不明了 缺乏neo 及EMCV IRES的复制子复制效率更高。H/?E1-P7 H/SG-5′HE H/SG-neo 表明EMCV IRES并非HCV体外复制及复制酶表达所必需 不同基因型之间，亚基因组与全基因组的复制效率不一致，Con1全基因组在15%Huh-7.5细胞中复制，而亚基因组为65%；H77复制子全基因组与亚基因组复制效率是一致的，15%与18%。这种差异强调研究不同基因型复制子的重要性 迄今，在全基因组复制子研究中，未见HCV颗粒的装配及释放，其它基因型是否也存在这种现象有待研究 HCV复制子的应用 HCV复制相关基因结构及功能研究 HCV与宿主细胞间相互作用的研究 抗HCV药物的研发及筛选 HCV复制相关基因结构的研究 发现HCV　5-UTR在复制及翻译中的作用 发现HCV　3-X尾在复制的作用中 NS5B突变对复制的影响 The variable region in the 3 NTR enhances RNA replication. (A) Representative result of a transient-replication assay with luciferase eplicons carrying given engineered restriction sites in the variable region of the 3NTR. (B) Transient replication of luciferase replicons lacking part or the complete variable region (Δvar-9401 and Δvar-9415, respectively). (C) Effects of mutations in the variable region of selectable replicons on the number of Geneticin-resistant colonies. Determination of the minimal length of the poly(U/UC) tract required for RNA replication. (A) Result of a transient-replication assay using luciferase replicons that carry a homopolymeric uridine tract of 1, 6, 26, or 46 nucleotides. (B) Number of Geneticin-resistant colonies obtained after transfection of selectable replicons with the same modifications in the 3 NTR in panel A. Representative results obtained after transfection of 100 ng