HPLC法测定人工合成色素（一二）.pptVIP

* 甲醇：有毒；氨水、乙酸铵、乙酸有刺激性气味 * * * * * * * * * * * * * * * * * HPLC法测定饮料中人工色素 2014.4.28 * 课程目的： 掌握食品中人工色素的提取分离和测定方法； 了解高效液相色谱的工作原理及操作方法。 * 着色剂：通过使食品着色后改善其感官性状，增进食欲的一类物质，这类食品本身具有色泽，因此又称为色素。 天然着色剂：辣椒红、甜菜红、红曲米、胭脂虫红、高粱红、叶绿素铜钠、姜黄、栀子黄、胡萝卜素、藻蓝素、可可色素、焦糖色素等等。 合成着色剂（人工色素）：用人工合成的方法从煤焦油中制取，或以苯、甲苯、萘等芳香烃化合物为原料合成的有机色素。包括苋菜红、柠檬黄、亮蓝、日落黄、诱惑红、赤鲜红等等。 * 方便、快速、准确地检测食品中人工色素，是对其进行有效管理的必要手段。 测定手段（GB/T 5009.35-2003）： 高效液相色谱法 薄层色谱法 分光光度法 * 柠檬黄、日落黄、苋菜红 * 一、实验原理 聚酰胺吸附法提取人工色素 聚酰胺（尼龙）通过氢键吸附色素，天然色素（影响测定）在酸性条件下被洗脱去除，人工色素在碱性条件下被洗脱收集，浓缩后上机测定。 吸附——洗涤——解吸附——浓缩——上机 理化测定一般步骤：除杂质、收集目标物、调整浓度、上机 * 试剂 配方 作用 聚酰胺粉 3g 吸附 PH 4的水（70℃） 水+柠檬酸溶液，调至PH 4，加热 洗涤 甲醇-甲酸溶液 60mL甲醇+40mL甲酸 洗涤 无水乙醇-氨水-水 70mL乙醇+20mL氨水+10mL水 解吸附 乙酸铵溶液 1.54g乙酸铵，纯水定容至1000mL，乙酸调PH至4 流动相 人工色素标准溶液 浓度0.05mg/mL 定量分析 其他 乙酸、甲醇、氨水、蒸馏水 二、实验试剂和器材 * 二、实验试剂和器材 器材： 烧杯、玻棒、吸管、移液管、G3漏斗、抽滤瓶*2、 针筒、温度计、5mL离心管 电子天平、水浴锅 * 三、实验步骤 1、人工色素的提取 2、人工色素的色谱分析 * 一 人工色素的提取 1. 1. 取样、脱气 称取饮料20ml，倒入50mL烧杯，碳酸饮料用电炉加热或超声除去二氧化碳。（已脱气）。 1. 2. 色素吸附 称取聚酰胺3g，用少许pH4的水（70℃）调成糊状，加入待 测样品，搅拌5min。 注：聚酰胺糊化的过程中需边加边搅拌。 * 1. 3. 除去非人工色素类杂质 1） 组装好G3漏斗，将样品倒入漏斗，抽滤； （用针筒抽吸的过程中不要抽出太多，易损坏针筒） 2）用 PH4的水（70℃）洗涤3次，每次20mL； （洗涤可溶性的杂质；大约20mL,不用很精确） 3）用甲醇-甲酸洗涤3次，每次20mL； （洗涤天然色素） 4）用PH4的水洗涤，至滤液PH为4。 注：滤瓶中的废液从瓶口倒出，而非瓶身中与橡胶管连接口处。 * 1. 4. 解吸附 更换抽滤瓶。用乙醇-氨水-水溶液洗涤三次至无色（5mL、10mL、 5mL），收集解吸液。 1. 5. 样品浓缩及保存 解吸液倒入蒸发皿中，80℃水浴蒸发至约2mL，用pH试纸检测浓 缩液的pH，若pH 6-7，则直接定容，若pH 7，以乙酸（一小滴） 调节PH至6-7。收集样品至离心管，加水定容至5mL并离心；标记并 保存于4℃冰箱，以备上机测定。 * 3g聚酰胺 20mL饮料 70℃ PH4水，糊状 加热脱气 混合搅拌5min G3漏斗抽滤 70℃ PH4水，20mL，洗3次 甲醇-甲酸，20mL，洗3次 70℃ PH4水，400mL洗涤 乙醇-氨水-水，洗三次，5ml、10mL、5mL 更换抽滤瓶 收集滤液，80℃水浴至2mL 乙酸调PH至6，离心管定容至5mL，4℃冰箱保存 抽滤过程注意搅拌、倒废液 清洗漏斗：自来水-盐酸-蒸馏水 目标物 注意密封性！ 直至漏斗下水滴PH为4 直至漏斗下水滴为无色 1小滴 * （二）人工色素的色谱分析 * 色谱法基本原理 色谱法（又层析法）：是一种物理或物理化学的分离分析方法。是利用混合物中各组分在两相（固定相和流动相）中由于吸附、分配、离子交换、亲和力、或分子尺寸等差异，使固定相对各组分的保留作用不同，作用力弱的组分随流动相迅速向前移动 , 作用力强的组分则滞留在后, 使各组分具有不同的移动速度, 而混合物因此得以分离。 * 高效液相色谱法 高效液相色谱法（HPLC）：是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的定性定量分析。 检测器：紫外检测器 高效、高速、高灵敏度、高自动化 * 结果分析 保留时间（定性）：组分从进样到出现信号最大值时的时间；