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医学生物化学基本实验 第一节 蛋白定量分析实验 蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要组成成分，它是构成人体及所有动物机体组织的主要部分。蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互连接而成的复杂的高分子化合物。蛋白质含量可通过它们的物理化学性质，如折射率﹑比重﹑紫外吸收﹑染色等测定而得知，或用化学方法，如微量凯氏定氮﹑folin-酚试剂、双缩脲反应等方法来测定，表2-1为五种蛋白质的测定方法的比较。 表 五种蛋白质测定方法比较 方 法 灵敏度 原 理 干扰物质 凯氏定氮法 Kjedahl法 0.2～1.0mg 将蛋白质转化为氮，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 双缩脲法 Biuret法 1～20mg 多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 Folin-酚试剂法 Lowry法 5μg 磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 考马斯亮蓝法 Bradford法 1～5μg 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100； SDS 紫外吸收法 50～100μg 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸 实验一 双缩脲法测定蛋白质含量 【实验目的】 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 【实验原理】 蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。 【实验内容与方法】 1. 标准曲线的制作 1 取小试管7支，编号，按表2-2操作表2-2 双缩脲法操作步骤 试剂（ml） 管 号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液 生理盐水 双缩脲试剂 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 — 样品0.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 0.9 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2 混匀后，于37℃水浴中保温15min，在50nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。 2. 样品测定 取血清（或其它蛋白质溶液）0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加二缩脲试剂4ml，于37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每l00ml血清（样品）中蛋白质的克数。 【实验准备】 1. 双缩脲试剂 称取CuSO4·5H20 2.5g，加水100ml，加热助溶，另取酒石酸钾钠10g，碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/L NaOH 300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加水至1000ml，此液可长期保存。 2. 生理盐水标准蛋白质溶液2mg/ml 3. 仪器及玻璃器皿 721型分光光度计，水浴箱，中试管6支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，坐标纸 实验 考马斯亮兰法测定蛋白质含量 【实验目的】 1. 掌握考马斯亮兰结合法对蛋白质定量测定的方法及原理 。 2. 熟悉紫外分光光度计的使用。 【实验原理】 考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，通过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。应用考马斯亮兰法的优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1μg。（2）测定速度快、简便，只需一种试剂。（3）干扰物质少。 【实验内容与方法】 取试管3支、编号，按表2-4操作表2-4 考马斯亮兰法测定蛋白质 试 剂（ml） 空白管 标准管 管 生理盐水 0.1 标准蛋白溶液 0.1 样 品 0.1 考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.0 2. 混匀，室温放置5min，在波长595nm处，以空白管调零点。测定各管的吸光度值。 3. 计算 【实验准备】 1. 考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G-250 100mg，加95%乙醇溶液50ml，使之溶解，再加入85%磷酸溶液100ml，加水至1000ml。混匀，避光放置过夜，用二层滤纸过滤，滤液用棕色瓶保存，至少可保存两周。 2. 标准蛋白溶液50μg/ml 3. 仪器及玻璃器皿 721分光光度计，试管l0支，刻度吸管10ml、l5ml、lml、0.1ml各1支，普通玻璃比色杯4只