抗冻基因cbf表达载体构建及转化紫花蓿.doc

抗冻基因CBF2表达载体构建及转化紫花蓿 摘要: 以拟南芥基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上构建成克隆载体T-CBF2。用BamHⅠ和SacⅠ分别对克隆载体T-CBF2和植物表达载体PBI121进行双酶切,获得目的片段和线性质粒。在T4DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成植物表达载体P-T-CBF2。采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌EHA105。 关键词: 抗冻基因CBF2;载体构建;农杆菌;紫花苜蓿;转化 正 文： CBFs 冷诱导基因 由一个小的基因家族编码,包含3个成员CBF1、CBF2和CBF3,3个基因都聚集在拟南芥的4号染色体短臂上,紧密连锁在一起,均可在冷胁迫下迅速诱导表达。CBF这一冷驯化关键调节基因的发现,对植物逆境胁迫生理和抗逆植物基因工程研究产生了一定影响。CBF在植物中是相当保守的,即使是对冻害敏感的番茄 Lycopersicon esculentum ,也存在具功能的CBF基因。另外,过量表达CBF除了提高拟南芥 Arabidopsis thaliana 抗冻能力外,也增强了拟南芥对干旱和盐的抗性,因此CBF可作为农作物抗逆基因工程的重要基因。 苜蓿，为温带地区重要的牧草,是重要的饲料农作物,低温是制约其生长的限制因子之一,因此抗冻基因导入苜蓿是具有重大的生态效益和经济效益的。期待通过CBF2单基因的导入显著提高苜蓿对低温的适应能力,使优良苜蓿在高寒气候区的种植成为现实,也为今后转化其他经济作物,利用CBF2基因综合改良这些作物的抗逆性奠定基础。 1．材料与方法 　1.1供试材料： 和田苜蓿 Medicago sativacv. Hetian ；大肠杆菌 Escherichia coli DH5α、根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens EHA105、PBI121载体; 质粒pGEM-T Easy Vector限制性内切酶、 T4DNA连接酶及高保真DNA聚合酶。 1.2.CBF2基因组DNA的提取 用CTAB 十六烷基三乙基溴化铵 法[8],略加修改。取培养15 d的拟南芥无菌苗。 （1 称取200 mg叶片,在液氮处理下,在研钵中研磨成粉末状。 （2 2 mL离心管中加入800μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液、80μL无水乙醇,颠倒离心管,使叶片粉末与提取缓冲液充分混合均匀,置于65℃恒温水浴中30 min,每隔5 min颠倒离心管数次。 （3 30 min后取出离心管自然冷却至室温,4℃12 000 r/min离10 min。 （4 吸取上层清液于另一离心管,加入等体积的氯仿,颠倒混匀,在室温下12 000 r/min离心10 min。 5 转移上层清液至另一新的离心管中,加入2倍体积冰预冷的无水乙醇,轻轻混匀。于-20℃下放置30min,使DNA充分缠绕成团。 （6 将上述有絮状沉淀的DNA离心,4℃12 000 r/min,离心10 min,倒掉上清液。 （7 挑取絮状沉淀,加入70%乙醇清洗2次。风干,最后加入100μL TE 10 mmol/L, pH 8.0 Tris-HCl,1 mmol/L EDTA 缓冲液充分溶解DNA沉淀。 （8 -20℃下贮存备用。 1.3　PCR polymerase chain reactoin,聚合酶链式反应 根据Gene Bank的CBF2cDNA已知序列,设计合成1对引物[9,10],并根据构建植物表达载体的需要在引物5′端分别引入了BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点。正向:5′-GC GGATCC ATGAACTCAT TTTCTGCCTTTTCTG-3′,反向:5′-GC GAGCTC TTAATAGCTC CATAAGGACA CGTCA-3′,以CBF2基因组DNA为模板。反应程序:94℃3 min→ 94℃30 s→57℃30 s→72℃1 min 30 此步骤为30个循环 →72℃10 min。热启动法加酶。所用酶为Taq Plus DNA Polymerase Taq+Pfu PCR仪为Mini CyclerTM 基因扩增仪 。 1.4　目的片段的纯化回收 对PCR产物开展琼脂糖凝胶电泳,用DNA快速纯化回收试剂盒回收目的片段具体操作按产品说明书进行。 1.5　克隆载体的构建 所用载体为PGEM-T Easy Vector T载体系统 ,该载体专为PCR产物的克隆而设计,具有氨苄青霉素抗性标记,可以进行蓝白筛选,便于进行酶切鉴定和测序。连接反应体系: 3μL纯化后的PCR产物+2μL 10×Ligation Buffer 连接缓冲液 +1μL 50 mg/L PGEM-T Easy Vector+1μL T4DNA L