VIGS實验方案.docVIP

VIGS实验方案 VIGS载体的构建 图1 BSMV重组病毒载体图谱目的片段 根据K5570、K4588基因3’-UTR设计一对引物，并在上、下游引物5’端分别引入Pac I、Not I酶切位点，随后进行PCR扩增反应。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，回收目的扩增片段，并与pMD18-T克隆载体连接，随后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞中，通过菌落PCR筛选阳性克隆并进一步测序验证。选择序列正确的克隆摇菌，提取质粒，分别用Not I和Pac I双酶切上述载体和γ载体质粒DNA。琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒纯化回收双酶切后的载体片段和目的基因片段，将纯化回收的5570、K4588基因片段连接到γ载体多克隆位点上，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR筛选阳性克隆，将序列及插入方向正确的克隆进行摇菌，并提取质粒γ-5570、γ-K4588 图1 BSMV重组病毒载体图谱 目的片段 2. 质粒线性化 α、γ-GFP质粒用MluⅠ酶切，β质粒用SpeⅠ酶切、γ- 4470及γ- 4588质粒用BssHⅡ（TAKARA）酶切。以上质粒各酶切6ug，分3管进行，每管50ul体系，加入2ug质粒。 （1） α、γ-GFP质粒 MluⅠ 2ul α/γ-GFP 2ug 10×H buffer 5ul ddH2O to 50ul ℃ 4h （2） β质粒 SpeⅠ 2ul Β质粒 2ug 10×M buffer 5ul ddH2O to 50ul 37 ℃ 4h （3） γ- 4470、γ- 4588质粒 BssHⅡ 2ul Β质粒 2ug 10×M buffer 5ul ddH2O to 50ul 50℃ 过夜 酶切反应结束后，每管各用1ul进行电泳检测，根据超螺旋的DNA在琼脂糖电泳中的迁移速率比线性化的DNA迁移率高，判断质粒是否完全线性化。在酶切反应结束后， 对上述所用限制性内切酶进行灭活：MluⅠ、SpeⅠ在65 ℃条件下温浴20min灭活，BssHⅡ在80 ℃条件下温浴20min灭活。 3. 线性化质粒的回收纯化 此步开始为RNA水平操作，所用枪尖、离心管均用0.1%DEPC处理，水为DEPC配制水，3M醋酸钠用DEPC水配制并灭菌一次，70%乙醇用DEPC水配制，无水乙醇为新的未开封过的乙醇。 酶切后线性化的质粒3管混合共150ul，用DEPC水定容至600 ul后加入等体积的苯酚：氯仿混匀， 室温12000rpm，离心30min，取上清。 加入等体积氯仿混匀。 室温12000rpm，离心30min，取上清。 加入1/10体积3M醋酸钠，混匀后加入2倍体积无水乙醇，-20 ℃沉淀过夜。 4℃，12000rpm，离心10min，取上清。 70%乙醇洗涤沉淀一次。 沉淀干燥。 20ulDEPC水溶解。 4、体外转录反应 使用RiboMAX Large Scale RNA Production Syetems—T7（Promega）体外转录试剂盒进行体外转录反应α、β各做3个反应，按20ul体系配制： 5 ×Reaction Buffer 4ul rNTP Mix（GTP 2mM, else 25mM） 6ul 线性DNA模板 2ug Ribo m7G CAP 1.5 ul Enzyme Mix 2ul Nuclease-free water to 20ul γ- GFP、γ- 5570、γ-4588各作1个反应，分别按7ul配制： 5 ×Reaction Buffer 1.4ul rNTP Mix（GTP 2mM, else 25mM） 2.1ul 线性DNA模板 0.7ug Ribo m7G CAP 0.53 ul Enzyme Mix 0.7ul Nuclease-free water