生物技术 5-3.ppt

生物技术第三章 PCR技术 3.1 PCR原理 3.2 定量PCR PCR原理 PCR反应 变性 复性 延伸 PCR反应包括三个步骤 双链DNA在高温下形成单链 变性 ; 低温下引物与单链DNA互补配对 退火 ; 在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物沿模板延伸。 重复3个基本步骤，可以在数小时内使特异DNA片扩增数百万 倍。 标准PCR反应体系 引物 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 引物的重要性 引物设计原则 1. 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个； GC含量一般40-60%，GC含量太低导致引物Tm值较低，太少扩增效果不佳，也易于引发非特异扩增。 5. 引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析 或分子克隆很有好处。 6.引物长度： 一般通过引物长度和退火温度控制特异性。如果PCR 的退火温度设置在近于引物Tm值 引物/模板双链的解链温 度 的范围内，20个碱基左右的Oligo，应具备很好的序列 特异性。 7.保守性 通用引物——扩增同一类分子 8. 引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； 用Blastn软件进行同源性比较, 尽可能选择与非目的基 因同源性小的序列作为引物, 选择3’端