第3章氨基酸分析.ppt

——蛋白质的构件分子 （一） 蛋白质水解 蛋白质和多肽的肽键可被催化水解 酸/碱能将蛋白完全水解 酶水解一般是部分水解 ----C-C-C-C-COOH γ β α ----C-C-C-C(NH2)-COOH α-氨基酸 ----C-C-C(NH2)-C-COOH β-氨基酸 ----C-C(NH2)-C-C-COOH γ-氨基酸 大多数AA在中性pH时呈兼性离子状态: 除甘氨酸外，19种AA都具有旋光性。 除胱氨酸和酪氨酸外，其余AA都能溶于水。 二、氨基酸的分类 三、氨基酸的酸碱性质 （三）氨基酸的等电点 当溶液为某一pH值时，AA主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目相等，净电荷为0。这一pH值即为AA的等电点（pI）。 在pI时，AA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。 对于侧链含有可解离基团的AA pI取决于两性离子两边pK’值的算术平均值 酸性AA：pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2 碱性AA：pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2 四、氨基酸的化学反应 五、AA的光学活性和光谱性质 （二）氨基酸的光谱性质 可见光区：无吸收 远紫外和红外区：都吸收 近紫外区（200—400nm）：Tyr/Trp/Phe 原因：-C=C-C=C-C=C-C=C- 六、氨基酸混合物的分析分离 （二）分配柱层析 填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、 淀粉、硅胶等，收集的组分用茚三酮 显色定量。 （五）离子交换层析 （七）高效液相层析 固定相支持剂颗粒细，表面积大； 采取高压，洗脱速度快。 1、紫外吸收光谱 Trp 280nm Tyr 275nm Phe 257nm 蛋白质含量测定 280nm ２、核磁共振波谱 ——利用AA成分分配系数的差异 （一）分配层析法的一般原理 { 层析系统 固定相 { 流动相 附着在固相上的液体 固体 按两相所处状态分： 气固层析 液固层析 固体 液液层析 液体 流动相 固定相 气液层析 液体 气体 与纸层析相似， 纸用其它高分子有机吸附剂代替 薄膜 将有适当粘度的固定相涂在薄板上 薄层 固定相装于柱内 固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，用流动相展开 纸 柱 按操作形式分： 固定相只能与一种组分结合， ——分开其它无亲和力的组分 亲和 离子交换剂 亲和性不同 离子交换 固体 吸附能力不同 凝胶 多孔凝胶， 通过速度不同 液体 分配系数不同 分配 吸附 按层析原理分： 固定相 各组分对固定相 甘氨酸滴定曲线 （一）α-氨基参加的反应 1.与亚硝酸反应 2.与酰化试剂反应 3.烃基化反应 4.形成Schiff’s碱反应 5.脱氨基反应 NH2 OH R CH COOH + HNO2 R CH COOH+H2O+N2 Van Slyke 法测氨基氮（体积）的基础。 N2中的1/2为氨基氮。 氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。 NO2 F O2N + H2N—CH—COOH R NO2 O2N HN—CH—COOH R + HF 弱碱性 DNP-氨基酸 （黄色） DNFB Sanger 法测定N末端氨基酸基础 —N=C=S + N—CH—COOH H H R PITC —N—C—N—CH—COOH H H R S PTC-氨基酸 —N—C H R S N C C O PTH-氨基酸 pH8.3 无水HF 苯异硫氰酸酯PITC 苯氨基硫甲酰衍生物 苯乙内硫脲衍生物 Edman降解法基础  R’ COOH R’ COO C=O + H2N CH C=N CH H R H R 醛 氨基酸 Schiff’s碱 -H20 +H20 在生物体内经AA氧化酶催化 即脱去α-氨基而转变为酮酸。 （二） α-羧基参加的反应 1.成盐或成酯反应 2.成酰氯反应 3.脱羧基反应 4.叠氮反应 （2）成酯  NH2 干