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OE—PCR快速合成基因的探索研究 　　摘要：根据GenBank中基因序列，利用DNAworks3.1软件，选择合适的参数优化设计引物。通过一步简单的重叠延伸PCR（OE-PCR），然后使用最外端的引物进行PCR扩增得到完整的基因序列。结果表明，利用该方法不但成功地合成了几个具有毕赤酵母密码子偏好性的基因，而且一次向野生型Cip基因里引入了12个点突变，并可以低成本、低错误率甚至是正确无误地合成1.5 kb以内的任何已知基因。 　　关键词：基因合成；DNAworks3.1软件；重叠延伸PCR（OE-PCR） 　　中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）12-2929-05 　　Study on Rapid Gene Synthesis Method by Overlap Extension（OE）-PCR 　　DONG Bing-xue1，HAN Xue-mei1，BI Shu-ping2，GENG San-chun1，LIU Wei1，LI Yun-hui1，ZHAN Hui-ying1 　　（1.School of Life Science and Technology， Nanyang Normal University， Nanyang 473061， Henan，China； 　　2. Dengfeng Animal Husbandry Bureau in Henan Province， Dengfeng 452470， Henan，China） 　　Absract： Optimized primers were designed according to the sequences of proteins searched from Genbank and parameters inputted using DNAworks3.1 program. Complete genes were obtained through a step of assembly multiple overlapping oligonucleotides by PCR to generatethe template DNA and a step of amplification of the template DNA sequence with the two outermost primers. The results showed that several genes with yeast codon bias had been synthesized successfully， 12 mutations were introduced simultaneously into Cip gene. This method enables DNA sequences with in sizes 1.5 kb be synthesized with few errors， eventually. 　　Key words： gene synthesis； DNAworks3.1 program； overlap extension（OE）-PCR 　　近年来，基因合成已经广泛应用于多个领域，例如生物大分子合成[1]，密码子优化[2]，DNA疫苗构建[3]等。目前基因合成的方法有许多，如寡核苷酸连接法[4]、Fok I法[5]、自身引物PCR[6-8]、双不对称PCR（Dual asymmetrical PCR，DA-PCR）[9]、重叠延伸PCR（Overlap extension PCR，OE-PCR）[10]、模板指导的连接法（Template-directed ligation，TDL）[11]、等温单向生长法[12]等。Stemmer等[10]报道的OE-PCR因简单、快速而较为常用。OE-PCR使用长40 bp、互相重叠20 bp的寡核苷酸引物，通过一步简单的重叠延伸PCR，然后用最外端的两条引物进行扩增就可以得到完整的基因。然而这种方法并不适合所有的基因[13，14]，针对不同基因需要做不同的条件优化。Young等[15]针对一步法OE-PCR技术的缺点，将双不对称PCR技术和OE-PCR技术相结合，发展了一种称为两步法OE-PCR的技术，对所有的寡核苷酸都使用同一套设计方法，大大降低了基因拼装过程中的错误。 　　本研究对OE-PCR进行了一系列优化，包括使用DNAworks 3.1软件设计引物代替人工设计，控制引物长度在45 bp以下、使重叠区的解链温度（Tm）高度相近、分散基因中集中A、T碱基；使用高保真的Primerstar HS DNA聚合酶代替Taq+