植物材料的培养组培及农杆菌侵染.docVIP

三、感受态细胞的制备及转化 热激感受态细胞的制备 实验试剂 CCMB80：KAc 10ml(use 1M stock,pH9)，CaCl2*2H2O 11.8g，甘油 100ml，定容至1L 用时每98 ml CCMB80加入1ml MnCl2*4H2O(2M)和1ml MgCl2*6H2O(1M) HCl调节pH6.4 实验步骤 1）划平板活化菌种（DH5α），挑单菌落37°C摇小管过夜，转大瓶,待OD600=0.6～0.7将装菌的大瓶置于冰上15分钟。 2）750-1000 g (2000-3000rpm)离心12-15分钟，弃上清。必要时可用吸滤器吸干。 3）加入离心下来细菌体积的1/3的CCMB80，轻柔的将菌摇散。置于冰上20分钟。 4）重复步骤2。 5）用原来大瓶菌液体积的1/12.5 CCMB80, 轻柔的将菌摇散。置于冰上15分钟。 6）分装，每管100μl，管子需-70预冷。 7）速冻，-70°C存放。 电击感受态细胞的制备 方法一、 实验试剂 重蒸水，10%甘油，20%甘油 实验步骤 1）同热击感受态步骤1，用X-L1 Blue菌种。 2）5000 rpm离心,20分钟，小心倒去上清，加入少量重蒸水, 轻柔的将菌摇散。 将离心管加满水，混匀，离心(5000rpm)。 3）同步骤2，洗2次。 4）同步骤2用10%甘油洗一次。 5）弃上清后，用与细菌体积相同的20%甘油将细菌均匀分散，分装到预冷的500 ul离心管中，每管50μl。 6）速冻，-70度存放。 方法二、 （以50ml菌为例） 试剂 1M CaCl2（14.7g CaCl2溶于100ml H2O），分装成1.2ml/管。使用时稀释成0.1M CaCl2（1.2ml 稀释成12ml） 步骤：（50ml 菌） 划平板活化菌种，挑单菌落37℃摇小管2ml过夜，1：100放大（0.5ml 菌→50ml 菌），待OD600=0.3-0.4，将装菌的瓶子置于冰上10-30min。同时冰上预冷0.1M CaCl2，冷冻离心机4℃预冷。 3000rpm离心10分钟，迅速弃尽上清。 用10ml CaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。置于冰上30分钟。 2500rpm离心10分钟，迅速弃尽上清。 用2ml CaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。每管200μl ，管子需预冷 置于冰上2hr-48hr内使用 热击 冰上30min，42℃ 90sec，并上10min。加入200 μl LB 37℃复苏2hr。 农杆菌感受态细胞的制备（电击） 1）接种小养（eg.3ML）28℃培养过夜。 2）1:100放大培养（eg。300ML YEB中）至OD=0.5。 3）ice chilled?? 5000rpm 10min (冷冻离心机,预冷到4℃)。 4）Washed by 1mM HEPES (PH7.0) 3次(每次10ML)。 5）10%甘油洗一次。 6）溶于3ML 10%甘油中,40ｕL 每管于 -70℃保存。 备注:离心管,dorf管,HEPES,甘油均须冰上预冷,所有的操作以在冰上进行为好. 另：农杆菌电击感受态细胞还可按大肠杆菌电击感受态细胞同样的制作。 农杆菌电击转化实验 1)调节电击仪,使其电脉冲为25ｕF,电压为2.5KV,电阻为400Ω。 2)从-70℃冰箱中取出电击感受态细胞（EHA105）,置于冰上使其融化。 3)加1ｕL质粒于感受态细胞中，轻轻混匀。 4)将上述菌液和DNA悬液加进电击杯的底部，迅速将电击杯放进电击仪。 5)按设定的参数,启动对细胞的电脉冲。 6)电击以后，尽快取出样品，加入1ML无抗YEB培养基。 7)将上述菌液转入1.5MLdorf管中，28℃ 2小时以上。 8)将菌液涂布在加有相应抗生素的YEB培养基上， 28℃培养2-3天，直至菌落长出。 备注:所有操作最好在冰上进行；电击杯电击之前在冰上预冷；电击杯中要除去气泡。 农杆菌感受态细胞的制备（热击） 从YEB和YEP培养基平板上分别挑取单菌落，接种于含有3ml 液体培养基的试管中，28℃振荡培养16~18h。 从试管中取出200μl菌液接种于含20ml 相应液体培养基中（100倍稀释），培养4~6 h至对数生长期。取1.5ml菌液加入到1.5ml 的无菌离心管中，4℃，3000rpm离心5min，弃上清。沉淀用800μl的预冷TE溶液（10mM Tris-HCl pH7.5；1mM EDTA pH7.5）洗一次，4℃，3000rpm离心5min，弃上清。 沉淀用800μl的YEB（YEP）培养基重新悬浮，然后按每管200μl分装到1.5ml 的无菌离心管中，液氮速冻后于-70℃保存备用。 农杆菌热击转化实验 转化前将保存的感受态细胞在冰上融化。 加入0.5~1μg质粒DNA，