菠菜actin基因片段的克隆要点.pptVIP

菠菜actin基因片段的克隆 植物基因组DNA提取 DNA的PCR扩增及其产物回收 DNA与载体的连接和转化 是基因工程中最基本的操作技术 主要包括以下实验技术： 基因工程 狭义：人工创造DNA分子新组合的技术（即重组DNA技术） 广义：重组DNA技术及其产业化设计和应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术是指重组DNA技术；下游技术则涉及到基因工程菌或基因工程细胞的大规模培养以及基因表达产物的分离和纯化，动、植物转基因等 DNA重组 微生物发酵 分离、提纯 产品 生物反应器 狭义 转基因 广义 + 提取DNA 筛选文库/PCR 连接 载体 细胞 DNA 载体 重组载体 宿主 扩增（基因） 酶切 基因 基因 转化 + 上游技术 下游 为基因测序和其它研究和应用准备高质量的基因片段。 Your Text Your Text Your Text PCR及检测 连接 转化 筛选 实验流程及原理 Your Text 回收 鉴定 Your Text 测序 DNA提取 及检测 产物回收等 引物 ……………………………..... …………………………………… ……………………………….. …………………………………… 5’- 3’- -3’ -5’ 引物设计 正向引物(Forward)→ ←反向引物(Reverse) 正向引物：TCATTCTCTGATCCGTGCAG 1.对引物的一般要求 (1) 长度一般为 18-27 nt (2) GC 含量为 40-60% (3) 引物在模板内没有其它高度相似的序列 (4) 引物间和引物内不形成二聚体及发夹结构 (5) 引物之间的Tm值应基本相同（ Tm估计值与计算方法有关） (6) 3’端避免出现3个及以上连续的相同碱基 反向引物： AGGCAAGCTTTTCCTTCACA 3.引物设计工具 （1）引物设计软件 Oligo 6.44 Primer Premier 5.0 Dnastar （2）网上引物设计工具 Primer3 /primer3/input.htm 2. DNA序列的来源 （1）查询序列数据库 （2）查阅科技文献 （3）测序 The National Center for Biotechnology Information （） 例1：查询Spinacia oleracea actin gene序列 * /primer3/input.htm 例2：利用Primer3设计引物 ① 复制和粘贴DNA序列 ① ② ② ③ ② 勾选所需的引物 ③ 获取引物 连接 Taq酶能够在PCR产物的3 ’末端加上一个非模板依赖的A； T载体是一种带有3 ’ T突出端的载体； 在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。 高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体 转化 细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（CaCl2)等的处理后,细胞膜 的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。 3、鉴定-- α-互补 质粒载体带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。 宿主细胞存在可编码β-半乳糖苷酶C端部分的序列。 它们同时存在时，能恢复lacZ酶的活性，称为α-互补。 在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。 当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 Your Text Your Text Your Text PCR及检测 连接 转化 筛选 实验内容 Your Text 回收 鉴定 Your Text 测序 DNA提取 及检测 产物回收等 引物